HPLC-DAD法同时测定仙茸壮阳口服液中4种成分的含量

李 珊,王晓燕,王艳伟,赵一擎,蒋芦荻

河南省食品药品检验所,国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室,郑州 450018

仙茸壮阳口服液是由鹿茸（去毛）、仙茅、淫羊藿、巴戟天（盐制）、肉苁蓉、枸杞、刺五加浸膏、何首乌（制）共8味药材制成的红棕色黏稠状的口服液,味甜、微苦、咸,具有补肾壮阳的功效,用于体虚、阳痿、肾寒等的治疗[1]。针对该口服液的现行标准有2个,分别是《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第二册（WS3-B-0249-90）和国家食品药品监督管理局国家药品标准[WS-11481（ZD-1481）-2002-2012Z],其中WS3-B-0249-90中的标准过于简单,没有鉴别和含量测定项目,而WS-11481（ZD-1481）-2002-2012Z中虽然增加了含量测定项目,但也只通过淫羊藿苷一个指标性成分的含量控制该制剂的质量,旨在控制淫羊藿药材的质量。淫羊藿是仙茸壮阳口服液中十分重要的药材,具有抗疲劳[2-3]、调节免疫[4-8]、抗衰老[9]、抗肿瘤[10-17]、抗炎[18-22]等作用。由于市场上淫羊藿药材的质量参差不齐且存在伪品[23-25],故关注制剂中淫羊藿药材的质量非常必要。查阅文献发现,目前针对仙茸壮阳口服液质量控制的文献多只以淫羊藿苷1种成分为指标,对其淫羊藿药材投料的质量进行研究[26-27],难以全面地反映生产过程中所投入的淫羊藿药材的质量状况。本研究建立了同时测定仙茸壮阳口服液中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4种成分含量的高效液相色谱-二极管阵列检测器法,为仙茸壮阳口服液中淫羊藿药材投料的质量问题提供含量测定方法,旨在为进一步提高仙茸壮阳口服液的质量提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）;KQ-250E 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;XPE205 万分之一电子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]。

1.2 试药

朝藿定A 对照品（批号RF200811-04,质量分数98.84%,杭州斯坦福化工有限公司）;朝藿定B 对照品（批号RF201014-03,质量分数99.24%,杭州斯坦福化工有限公司）;朝藿定C（批号111780-201905,质量分数94.3%,中国食品药品检定研究院）;淫羊藿苷（批号110737-202017,质量分数98.1%,中国食品药品检定研究院）;乙腈（色谱纯,德国默克股份两合公司）;超纯水为自制;其余试剂均为分析纯。

18批仙茸壮阳口服液（编号为S1～S18）来自2021年国家药品抽检计划样品,由6个不同的厂家（编号为A～F）生产,样品信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Sample information

以下8味药材经雷留成主任药师鉴定均为正品:鹿茸（去毛,批号20181101,通化）;仙茅（批号1807001,云南）;巴戟天（盐制,批号1903001,广东）;肉苁蓉（批号T001-180602,内蒙古）;枸杞（批号181208,宁夏）;刺五加浸膏（批号200801,黑龙江林海雪原药业有限公司）;何首乌（制,批号1806001,四川）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱。流动相为乙腈（A）-水（B）,梯度洗脱:0～30 min,76%～74%B;30～31min,74%～55%B;31～45min,55%～53%B。流速为1.0 mL·min-1。检测波长为270 nm。柱温为30℃。进样量为10μL。结果见图1。各相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5,理论塔板数均大于12 000。

图1 HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 混合对照品储备液的制备

分别精密称取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷对照品适量,加甲醇溶解,制成质量浓度分别为140.272、101.780、93.920、122.664μg·mL-1的混合对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取仙茸壮阳口服液样品2 mL,置于10 mL量瓶中,加体积分数为50%的乙醇溶液适量,超声（200 W、40 k Hz）提取10 min,加体积分数为50%的乙醇溶液定容,用0.22μm 微孔滤膜过滤,即得。

2.4 缺淫羊藿阴性对照溶液的制备

朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4种成分均来自处方中的淫羊藿,故需制备缺淫羊藿的阴性对照溶液。取何首乌、巴戟天、枸杞、肉苁蓉、仙茅用体积分数为35%的乙醇溶液回流提取2次,第1次6 h,第2次4 h,合并提取液,过滤,将滤液浓缩至适量,加乙醇适量,搅拌,静置,过滤,滤液置于水浴锅中蒸至稠膏状;将鹿茸置于锅内蒸30～40 min,取出切片,用体积分数为40%的乙醇溶液适量温浸12 h以上,再回流提取4次,依次为3、3、2、2 h,合并提取液,过滤,将滤液浓缩至适量,加乙醇适量,搅拌,静置,过滤,滤液置于水浴锅中蒸至稠膏状,沉淀用体积分数为60%的乙醇溶液洗至无色,洗液静置,回收乙醇,浓缩至适量,合并2次回收乙醇的浓缩液,加体积分数为50%的乙醇至50 mL,使含醇量为20%～30%;另取炼制蜜蜂250 g、蔗糖250 g制成单糖浆,加入上述鹿茸液、刺五加浸膏、何首乌等稠膏,混匀,加入防腐剂适量及枸橼酸钠6 g,搅拌均匀,加水至1 000 mL,静置,过滤,即得缺淫羊藿阴性对照溶液。

2.5 线性关系考察

取混合对照品储备液0.5、1、2、5、10 mL,加甲醇稀释后定容至10 mL,得到系列混合对照品溶液。取储备液及系列混合对照品溶液适量,按2.1项下色谱条件进样测定,以系列混合对照品溶液的质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）,进行线性回归。结果见表2。

表2 仙茸壮阳口服液中4种成分的线性关系Tab.2 Linear relationship of the 4 components in Xianrong Zhuangyang Oral Liquid

2.6 精密度实验

取混合对照品溶液,按照2.1项下色谱条件连续进样测定6次,记录峰面积。计算得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷峰面积的RSD 值分别为0.63%、0.72%、0.56%、0.85%,表明仪器的精密度良好。

2.7 重复性实验

取同一仙茸壮阳口服液（S8）供试品6份,按照2.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件进样测定,计算得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的含量。结果见表3,RSD 值分别为0.81%、1.47%、1.04%、0.97%,表明该方法的重复性良好。

表3 仙茸壮阳口服液中4种成分的重复性实验结果 （n=6）Tab.3 Experimental results of repeatability of the 4 components in Xianrong Zhuangyang Oral Liquid（n=6）

2.8 稳定性实验

取仙茸壮阳口服液（S8）供试品溶液,分别于0、2、4、6、12、16、24、36 h进样测定。计算得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷峰面积的RSD 值分别为1.01%、1.7%、0.96%、1.13%,表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率实验

取已知成分含量的仙茸壮阳口服液（S8）供试品6份,各1 mL,分别精密加入朝藿定A 对照品溶液（质量浓度51.8μg·mL-1）、朝藿定B对照品溶液（质量浓度162.7μg·mL-1）、朝藿定C对照品溶液（质量浓度124.4μg·mL-1）、淫羊藿苷对照品溶液（质量浓度307.5μg·mL-1）各1 mL,按照2.3项下方法制备供试品溶液,按照2.1项下色谱条件进样测定。计算得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的平均加样回收率分别为97.07%、96.70%、97.64%、97.73%,RSD值分别为1.74%、1.26%、2.68%、1.99%,表明该方法的准确性良好。结果见表4。

表4 仙茸壮阳口服液中4种成分的加样回收率实验结果（n=6）Tab.4 Experimental results of sample recovery of the 4 components in Xianrong Zhuangyang Oral Liquid（n=6）

2.10 样品含量测定

取18批仙茸壮阳口服液样品溶液,按照2.1项下色谱条件重复进样测定3次,计算样品中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4种成分的含量。结果见表5。

表5 仙茸壮阳口服液中4种成分的含量测定结果 （n=3）Tab.5 Determination results of the 4 components in Xianrong Zhuangyang Oral Liquid（n=3）

3 讨论

3.1 提取条件的选择

朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷均属于黄酮类物质,此类物质在有机溶剂中的溶解性较好,制备供试品时,考察了甲醇、体积分数为50%的甲醇溶液、乙醇、体积分数为50%的乙醇溶液4种提取溶剂,10、20、50 mL 3 种不同溶剂用量,超声和回流2种不同提取方法,5、10、20 min 3种不同提取时间对提取效率的影响,最终确定提取条件为应用10 mL体积分数为50%的乙醇溶液超声提取10 min。

3.2 色谱条件的优化

本研究比较了选用5种不同色谱柱[Agela-Venusil XBP C18（L）（250 mm×4.6 mm,5μm）;Phenomenex Luna C18（250 mm×4.6 mm,5μm）;SHIMADZU Shim-pack GIST（250 mm×4.6 mm,5μm）;Waters-Symmetrm C18（250 mm×4.6 mm,5μm）;Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm,5μm]及不同流动相系统对提取效率的影响,最后以乙腈作为流动相A,水作为流动相B,梯度洗脱,通过比较理论塔板数、分离度、信噪比等,最终确定选用Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱,该色谱柱可使4种成分获得最佳的分离效果。

3.3 检测波长的选择

采用DAD 检测器在200～400 nm 波长范围内对4种对照品和仙茸壮阳口服液样品进行扫描,综合考虑不同波长下色谱峰的数量、紫外吸收、分离度、峰面积大小,最终将270 nm 作为检测波长。

3.4 测定结果分析

仙茸壮阳口服液中的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷均来源于淫羊藿。由表4可知,18批仙茸壮阳口服液中4种成分的含量差异很大,朝藿定A 的质量浓度为0.019 1～0.061 4 mg·mL-1,朝藿定B的质量浓度为0.017 4～0.153 9 mg·mL-1,朝藿定C的质量浓度为0.026 5～0.265 0 mg·mL-1,淫羊藿苷的质量浓度为0.062 2～0.315 3 mg·mL-1;4种成分总含量的差异也较大,在0.204 6～0.692 9 mg·mL-1之间。这可能与不同厂家生产工艺不同、不同批次淫羊藿药材投料差异等因素有关。《中华人民共和国药典》2020版是以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷4种成分的总量来评价淫羊藿药材的质量,而在仙茸壮阳口服液的2个现行标准中,WS3-B-0249-90缺乏含量测定项目,WS-11481（ZD-1481）-2002-2012Z只以淫羊藿苷的含量控制制剂的质量,且将淫羊藿苷含量标准规定设定为质量浓度0.15 mg·mL-1。由表4可知,18批仙茸壮阳口服液中淫羊藿苷的含量能达到此标准的样品,即淫羊藿苷的质量浓度大于0.15 mg·mL-1的只有10批,可见单独以淫羊藿苷的含量控制制剂中淫羊藿投料的质量并不合理,存在将样品误判为不合格样品的风险,建议以朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的总含量控制该制剂中淫羊藿投料的质量。