超声处理对牦牛乳酶促凝胶流变特性的影响研究
2022-05-06宋雪梅
马 燕 梁 琪,* 宋雪梅
(1 甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2 甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃 兰州 730070)
乳蛋白形成凝胶是生产乳酪、酸乳等乳制品中最关键的一步，直接影响到产品的质量，常见的形成方式是酶促凝胶。酶促凝胶时，凝乳酶首先专一切割乳液中κ-酪蛋白Phe105-Met106之间的肽键，释放带负电荷并提供空间作用的糖巨肽于乳清中[1]。其次，糖巨肽被解离导致酪蛋白胶束之间的斥力降低，解离达到85%～90%时，酪蛋白通过疏水作用和钙离子的桥联作用结合在一起，形成一种孔径为微米级大小的网络结构[2]。最后，粒子间相互挤压、凝胶进行脱水收缩，导致乳清从凝胶网络结构中析出。凝胶的流变特性对乳制品的功能品质具有重要影响，脂肪与蛋白质的相互作用会影响凝胶的流变特性，其相互作用主要受脂肪球的形状、大小和粒度分布等因素影响[3]。Luo等[4]研究发现蛋白质在脂肪球周围形成凝胶的能力与其结构特征如疏水相互作用、电荷分布和三维结构等密切相关。
超声处理(ultrasonic treatment，US)会对液体分子进行拉伸和压缩，产生大量空穴并瞬间破裂，形成瞬时高温和高压等极端环境，使得乳液中脂肪球尺寸变小，脂肪球膜破裂[5]。而针对超声后全脂乳凝胶特性的研究极少，学者主要以脱脂乳为原料，专注于超声处理后蛋白质对乳凝胶特性的影响。研究发现，超声会改变脱脂乳中酪蛋白胶束的空间结构，引起蛋白质疏水性变化，使得凝胶网络改善[6-7]。
牦牛乳脂肪含量高(5.3%～8.8%)，脂肪球较大(平均直径为4.39 μm)，乳液体系不稳定[8]，且酪蛋白胶束的粒径大，凝胶形成速率慢[9]。Zhang等[10]研究发现牦牛乳中低浓度的κ-酪蛋白会影响酪蛋白胶束的酶水解速率，使得牦牛乳凝胶时间大于荷斯坦牛乳。牦牛乳的凝胶特性亟待改善。但目前超声技术牦牛乳制品加工中鲜有相关报道，且尚未对超声牦牛乳的酶促凝胶进行研究。基于此，本研究通过改变超声功率和处理时间，将不同超声能量密度应用于牦牛乳，探究超声牦牛乳的酶促凝胶流变特性，从乳蛋白疏水性和脂肪球粒径的角度分析凝胶网络形成，以期利用超声技术改善牦牛乳酶促凝胶流变特性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
2020年7月上旬在甘肃省甘南藏族自治州合作市多河乡获取检验合格的牦牛乳，将其存于恒温容器(4±2℃)中运输带回实验室，在4℃下保存备用。
发酵剂(嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种)，丹尼斯克中国有限公司；凝乳酶(小牛皱胃酶、牛胃蛋白酶，活力890 IMCU·g-1)，北京多爱特生物科技有限公司；其余药品均为分析纯。
1.2 仪器与设备
SCIENTZ-IID型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物股份科技有限公司；奥林巴斯BX53荧光显微镜，上海普赫光电科技有限公司；Bettersize2600激光粒度分布仪，丹东百特仪器有限公司；T6紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；TD5RZ乳脂离心机，湘仪离心机仪器有限公司；LVDV-1型数字旋转粘度计，上海方瑞仪器有限公司；pHS-3C型精密pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；MCR301流变仪，奥地利Anton Paar公司；F380荧光分光光度计，天津港东科技发展股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 牦牛乳的超声条件 超声发生器频率20 kHz，将直径6 mm的尖端伸入250 mL烧杯中进行超声处理。每次处理乳样200 mL，设定温度为15℃，样品浸入冰浴中，用温度探针连续记录样品的核心温度(20±5℃)，探头伸入液面约3 cm，超声工作3 s，间歇3 s。设计2个完全随机因素(超声时间5和10 min，超声功率300、400和500 W)，以未处理的牦牛乳作为对照样品(CK)，共7种处理条件，具体见表1。参照Balthazar等[11]的公式，计算应用到样品上的能量密度(energy density，ED)：
表1 牦牛乳超声处理条件
(1)
式中，P为超声功率，w；t为超声时间，min；V为处理样品量，mL。
1.3.2 超声牦牛乳脂肪、蛋白质及pH值测定 参考《GB 5009.6-2016食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》[12]中的第四法测定脂肪含量，《GB/T 5009.5-2010食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》[13]中的第一法测定蛋白质含量。取20 mL待测样品，用pHS-3C精密pH计测定样品pH值。
1.3.3 超声牦牛乳均质效率测定 参照Abesinghe等[14]的方法，将25 mL牦牛乳在1 292 r·min-1转速下于40℃离心30 min。用盖勃法测定脂肪含量。按照以下公式计算均质效率(homogenizing efficiency，HE)：
(2)
式中，m为底部20 mL样品的质量，g；M为整个样品的脂肪含量，g。
1.3.4 超声牦牛乳稳定性测定 根据Patil等[15]所述的重力法测量，用苏丹Ⅲ区分出乳脂。样品装入25 mL离心管在4℃存放24 h，测量相分离的程度，按以下公式评估乳液的稳定性(cream stability，CI)。
(3)
式中，Hc为乳脂层的高度，mm；Ht为乳的总高度，mm。
1.3.5 超声牦牛乳黏度测定 使用数字旋转粘度计，选用3号转子，转速为30 r·min-1。将超声牦牛乳在水浴中预热至35℃，取出20 mL，调节pH值为5.6，加入氯化钙及酶液，混匀30 s后，分别于0、10、20、30、40、50、60 min时记录黏度值。
1.3.6 超声牦牛乳酶促凝胶流变特性测定 参照Zhao等[16]的方法并稍作修改，将牦牛乳在35℃水浴保温10 min，分别取不同处理下的乳样4 mL，调节pH值为5.6，加入氯化钙，停留1 min，加入酶液，混匀，立即转移到流变仪平板上。测试条件如下：温度35℃，平行板60 mm，间隙1 000 μm，频率1 Hz，应力0.1 Pa，间隔10 s，时间60 min，测定均在线性粘弹性区域内。储能模量表征弹性属性，用G′表示；损耗模量表征粘性属性，用 G″ 表示。
1.3.7 超声牦牛乳浊度测定 参照Choi等[17]的方法并稍作修改，将处理后的样品摇匀后准确移取200 μL，用去离子水稀释至10 mL，室温下用紫外分光光度计在860 nm处测定样品溶液的吸光度，参比溶液为去离子水，平行测定3次，取平均值。
1.3.8 超声牦牛乳荧光特性测定 参照Yazdi等[18]的方法并稍作修改，25℃下采用荧光分光光度计测定其荧光发射光谱，用微量移液器移取超声牦牛乳100 μL，加入20 mL去离子水并混匀，荧光光谱激发波长为235 nm(狭缝5.0 nm)，发射光谱采集范围为200～800 nm(狭缝5.0 nm)，扫描速率为1 200 nm·min-1。
1.3.9 超声牦牛乳脂肪球的微观结构及粒径分布测定 参照Ménard等[19]的方法并稍作修改。将恢复至室温的牦牛乳轻轻晃动，取10 μL于载玻片上，用配备油浸透镜的光学显微镜(放大倍数100)观察牦牛乳微观结构并拍照。参照Luo等[8]的方法，使用激光粒度分布仪测量牦牛乳脂肪球的粒度分布。乳脂肪小球的折射率为1.458，水的折射率为1.333[20]。试验在室温下进行，将100 μL的样品滴入设备的测量池中，向池中加入1 mL 50 mmol·L-1乙二胺四乙酸-氢氧化钠的缓冲液(pH值7.0)，破坏酪蛋白胶束。
1.4 统计与分析
测定均重复3次。采用Duncan法进行差异显著性分析，结果以平均值±标准差表示。采用Excel 2010记录数据、SPSS 2019分析数据、Origin 2018绘制图表。
2 结果与分析
2.1 超声牦牛乳样品的基础指标
样品单位体积所受到的能量称作能量密度。由表2可知，不同超声功率和超声时间进行组合后，牦牛乳的能量密度不同。能量密度与超声功率和超声时间的乘积成正比。超声5 min的US1、US3、US5能量密度小于超声10 min的US2、US4、US6能量密度。能量密度由小到大排序为CK
表2 超声牦牛乳样品的基础指标
2.2 酶促凝胶形成中超声牦牛乳粘度的变化
凝胶结构形成是一个动态的过程，超声牦牛乳黏度的变化可以客观反映凝胶形成的进度。由图1可知，同一超声处理量密度的牦牛乳，随着凝胶时间的增加，黏度呈先增加后下降的趋势。相同凝胶时间下，US3的黏度均显著大于其他超声处理组(P<0.05)，US4的黏度仅次于US3，CK的黏度最低。凝胶30 min时，US1、US2、US3和US4的黏度达到最大值，凝胶40 min时，CK、US5和US6的黏度达到最大值，此时凝胶结构均已形成。酶凝胶形成后，乳清不断析出，导致牦牛乳黏度开始下降，脂肪和蛋白质的改变会使黏度发生变化。Tran等[22]研究发现由于酪蛋白和乳清蛋白的含量不足，难以覆盖新形成的脂肪小球的表面积，从而引起黏度改变。Mohan等[23]研究指出由于脂肪和酪蛋白之间的相互作用，导致黏度发生改变。
注：不同小写字母表示相同时间不同超声条件下，黏度具有差异显著性(P<0.05)；不同大写字母表示同一超声条件不同时间下，黏度具有差异显著性(P<0.05)。
2.3 酶促凝胶形成中超声牦牛乳的流变特性
乳凝胶是典型的粘弹性聚合物，储能模量反映所形成凝胶结构的强度。由图2-A可知，超声处理组的储能模量高于CK，超声处理使得牦牛乳酶促凝胶的弹性增加，凝胶强度变大。从各样品酶促凝胶过程中储能模量的变化趋势可知，样品的储能模量与凝胶时间呈正相关关系。US5和US6的储能模量增长最明显，分别为6 824 和7 189 Pa；US4、US2、US3和US1的储能模量增长依次为2 013、1 595、1 157 和564 Pa；CK的储能模量增长最小，为256 Pa。酶促凝胶形成中，随凝胶时间的延长，酪蛋白胶束构成的索状结构不断生成新键，变粗糙，导致储能模量增加。当超声时间相同时，样品储能模量随着超声功率的增加而增大。在相同超声功率下，超声10 min的储能模量大于超声5 min的储能模量。测量过程中，US4前13 min和US5前5 min损耗模量高于弹性模量，此时酶促凝胶结构形成受阻。CK、US1、US2、US3和US6的储能模量均大于损耗模量，故弹性响应是凝胶过程中的主要响应。图2-B表示损耗模量与凝胶时间的关系曲线，其趋势与储能模量相似，酶促凝胶的粘性变化类似于弹性变化。
图2 超声牦牛乳酶促凝胶过程中的储能模量G′和损耗模量 G″
损耗正切角Tanδ与酶促凝胶变形过程中化学键的松弛行为有关，其大小能表征牦牛乳凝胶网络的重排程度。由图3可知，Tanδ与凝胶时间呈负相关关系，随着凝胶时间的增加而逐渐降低。超声处理组的Tanδ高于CK，表明超声处理使凝胶网络大规模重排。US1、US2、US3和US4凝胶具有较低的析水现象，凝胶持水力提高。US5和US6的超声功率大，造成凝胶脱水收缩严重。
图3 超声牦牛乳酶促凝胶过程中的损耗正切角Tanδ
由表3可知，与CK的凝胶时间(9.35 min)相比，US1、US2、US3和US4分别将凝胶时间缩短了1.78、3.72、5.75和4.74 min，其中US3和US4的凝胶时间缩短了一半以上(61.49%和50.70%)，US5和US6的凝胶时间延长了8.74和22.96 min，凝胶网络不易形成。US1～US4凝胶时间缩短，是因为超声处理使酪蛋白胶束表面积增加，与凝乳酶结合位点更多地暴露出来，反应效率提高。US5凝胶时间延长，是由于脂肪球絮凝出现均质团簇，影响乳清蛋白从胶束聚集体中解离。US6凝胶时间延长，是由于超声过度，分子间的共价键变得脆弱，限制胶束的聚集。将不同超声功率和超声时间进行组合后，牦牛乳受到的能量密度不同，未发现凝胶时间与能量密度之间呈现规律性变化。但同一超声时间下，牦牛乳的凝胶时间受超声功率的影响明显，300或400 W均能有效缩短凝胶时间，500 W(US5和US6)时，功率过大，凝胶时间延长。超声处理后牦牛乳浊度显著降低(P<0.05)，说明超声处理使得牦牛乳酪蛋白胶束间的相互作用力改变。US1、US3和US4浊度较低且相互之间不存在差异显著性(P>0.05)。对所有样品储能模量曲线进行拟合，其中t为凝胶时间，G′为储能模量值，除US4拟合曲线的R2值为0.980 6外，其余曲线的R2值均大于0.990 0，说明曲线的拟合效果好。超声处理组的最大储能模量及最大损耗模量均显著高于CK(P<0.05)。
表3 超声牦牛乳酶促凝胶流变特性
2.4 超声牦牛乳蛋白疏水性对酶促凝胶网络形成的影响
疏水相互作用会影响蛋白质结构，与乳凝胶特性显著相关[24]。由图4可知，与未超声处理的牦牛乳相比，能量密度在600～900 J·mL-1的超声牦牛乳最大发射波长发生移动，表明此时的色氨酸内部疏水环境发生改变。600 J·mL-1的US3最大荧光强度显著增加了51.22%(P<0.05)，最大发射波长从359 nm蓝移至357 nm。这表明色氨酸内部的刚性环境减弱，芳香族氨基酸残基暴露，色氨酸残基埋藏在疏水环境中，分子内色氨酸猝灭作用减弱，导致酪蛋白分子结构被破坏。1 200 J·mL-1的US4内部蛋白质重聚集，导致最大荧光强度显著降低了5.31%(P<0.05)。400 J·mL-1的US1和1 500 J·mL-1的US6最大荧光强度均显著增加(P<0.05)，但最大发射波长无显著性变化(P>0.05)。这表明蛋白质分子内部发生膨胀，疏水性基团发生水合作用，使得酪氨酸和色氨酸等基团具有一定的自由转动度，但色氨酸依然保持在内部疏水环境中。
注：不同的字母表示在相同能量密度下，荧光数值之间具有显著性差异(P<0.05)。
2.5 超声牦牛乳脂肪球粒径对酶促凝胶网络形成的影响
光学显微镜图5显示，牦牛乳脂肪球以椭圆形球体存在于乳浆中，超声处理后脂肪球尺寸减小，但形状并未改变。CK中存在最大的脂肪球，粒径分布范围为0.427～33.320 μm，脂肪球集中分布在4.502 μm处。形成较大的脂肪球的原因是脂肪球从乳腺上皮细胞分泌后被包裹时，受到了脂肪球膜的限制[19]。超声处理牦牛乳后，脂肪球的峰形向左移动。US1与CK的脂肪球集中分布在同一处。由于超声能量密度过小，未能达到充分的均质化，使得US1中仍然存在较大的脂肪球。在US3中观察到更均匀的脂肪球，最高体积分数(10.54%)高于其他超声处理组，脂肪球粒径分布范围为0.300～4.002 μm，集中在1.974 μm处。US4的脂肪球粒径分布范围为0.131～4.502 μm，呈双峰分布，归因于小脂肪球聚集。US5中可明显观察到脂肪球聚集和絮凝，形成均质团簇，此时乳液处于不稳定状态。由于较小的脂肪球具有更大的脂肪酶固定表面积，其与脂肪酶缔合可以诱导小球的桥接，从而出现絮凝[25]。牦牛乳脂肪球膜组成和结构对脂肪酶的更高亲和力会导致更多的小球结合在一起，脂肪球聚集更明显[26]。随着超声能量密度的增加，脂肪球体积平均直径(D4,3)和脂肪球面积平均直径(D3,2)均呈现下降趋势，US2、US4和US6能量密度分别为900、1 200、1 500 J·mL-1，与CK相比，分别下降了84.12%、86.87%和88.66%。US6中脂肪球被打散，球形结构不明显，D3,2显著下降了87.29%(P<0.05)，原因可能是超声能量密度过大。
注：图中圈出部分代表脂肪球聚集。
注：不同小写字母表示不同能量密度下，D4,3(或D3,2)具有显著差异(P<0.05)。
3 讨论
牦牛乳营养价值高，是加工奶酪、酸乳等乳制品的优质乳源，但其凝胶速率慢、时间长，会影响生产效率。近年来，超声处理技术在乳制品中的应用日益增多，如均质化、灭菌、消泡、过滤和改变发酵速率等[27-28]。本研究发现超声处理后牦牛乳的脂肪含量和蛋白质含量无显著变化(P>0.05)，但均质效率和乳液稳定性显著提高(P<0.05)。由于均质效率的提高，填充在蛋白质网络结构中的脂肪更容易流动。石永祺等[29]研究指出流动的脂肪会减弱酪蛋白胶束间的相互作用。本研究发现利用超声处理技术可以改变牦牛乳蛋白表面疏水性，影响酪蛋白胶束体系的凝胶化。Shanmugam等[30]发现超声处理破坏酪蛋白-乳清蛋白的聚集体，引起乳清蛋白变性，但酪蛋白胶束和矿物质的完整性并未受到显著影响，还指出超声处理主要是减小脂肪球大小。本研究也发现超声处理牦牛乳后，脂肪球的峰形向左移动，粒径减小，脂肪球转变成较小的颗粒，小尺寸脂肪球表面被酪蛋白颗粒的疏水部分覆盖，形成新的脂肪球膜。事实上，脂肪球尺寸减小增加了脂肪球膜的表面积，而脂肪球膜表面积的增加本身就是脂肪球-酪蛋白网络的形成。脂肪与蛋白质的相互作用会对凝胶产生影响。Akdeniz等[31]研究发现超声增强了颗粒的部分迁移性，改善了蛋白和新形成的脂肪球-蛋白复合物之间的聚集。Nguyen等[32]指出新脂肪球膜的成分不同于天然的脂肪球膜，后者包含膜片段和酪蛋白，从而形成覆盖脂肪球的致密蛋白质层。本研究还发现，超声牦牛乳的蛋白疏水性及脂肪球粒径会对凝胶网络形成产生影响，小脂肪球与周围的乳蛋白基质交联，缩短了凝胶时间，导致更高的凝胶强度。Chandrapala等[33]研究发现大功率的超声会对凝胶产生不良影响，主要是因为乳清蛋白会从胶束聚集体中解离同时脂肪球絮凝形成均质团簇。本研究发现同一超声时间下，随着超声功率的增加，样品储能模量增大，凝胶时间缩短，然而功率过大(500 W)会对凝胶产生不良影响，延长凝胶时间。Scudinoa等[28]指出牛乳的胶体系统中存在一个物理化学边界，需要跨越该过程才能形成凝胶。有学者研究发现能量密度从990 J·mL-1增加至1 386 J·mL-1时，水牛乳脂肪球尺寸逐渐变小，其中1 188 J·mL-1的能量密度下脂肪球最均匀，乳液稳定性最好，具有较好的凝胶强度[14]。故在实际生产时，需根据具体要求对超声条件进行优化。
4 结论
本研究发现适宜的超声处理不仅不会改变牦牛乳的脂肪含量和蛋白质含量，与此同时，还提高了牦牛乳的均质效率和乳液稳定性，最终有效缩短凝胶时间，增加凝胶强度。但功率过大(500 W)会对凝胶产生不良影响，延长凝胶时间。超声处理改变乳蛋白表面疏水性的同时减小了脂肪球尺寸，从而影响脂肪和蛋白质的相互作用。酶促凝胶的最佳超声处理参数为功率400 W，时间5 min，但该参数仍需进一步优化。本研究证实了超声处理在牦牛乳制品生产中具有应用价值。虽然已经发现超声处理有助于改善牦牛乳酶促凝胶流变特性，但脂肪与蛋白质的相互作用对凝胶特性影响的内在分子机制还需要进一步探究。
