贵州名优茶与产地土壤矿质元素相关性及其溯源影响的研究

张忠梁 舒英格 何 季 任明慧

(1 贵州大学农学院，贵州 贵阳 550025；2 黔南州农业农村局，贵州 都匀 558000)

具有名特优商标或产地地理标志认证的食品所带来的经济效益，可能会诱使低劣原料假冒优质食品品牌，从而造成一系列食品安全问题[1-2]。在经济全球化、食品物流供应链全球化的今天，食品产地溯源及食品安全问题变得更为复杂，虽然欧盟、美国、日本等国家制订了一系列法律和标准认证措施来强化食品的安全性和可追溯性[3-6]，但现有的溯源体系及鉴别技术仍面临着巨大挑战。中国是世界茶叶产量最大的国家，贵州省茶园面积居全国首位，省内都匀毛尖、湄潭翠芽、凤冈锌硒茶等多种名优茶获得了国家地理标志并通过了欧盟食品认证。为防止外源劣质茶伪冒名优茶引发食品安全隐患、破坏地区茶叶品牌价值，需要研发一种有效的产地鉴别技术，以建立科学的茶叶产地追溯及判别手段。

近年来，国内外学者对食品产地溯源的研究愈发热门[7-8]。在技术手段上，主要依托稳定同位素[9-11]、近红外光谱[12]、多矿质元素指纹[13-14]、气相及液相色谱[15]等技术。其中，多矿质元素指纹法的优势在于矿质元素是农产品的基本组成成分，自身不能合成，须从土壤和水中摄取。因此，不同地域农产品形成了一定的矿物元素地域指纹特征，不易受后期加工、贮藏的影响[16]，相较稳定性同位素、气相及液相色谱法等技术稳定性强、技术成本低、判别可靠性高，是有效的产地溯源指标[17]。

针对茶叶产地溯源研究，前人多是通过茶叶本身所含的矿质元素[18-19]、化学成分等生化指标[20-21]进行溯源分析，而对土壤-茶叶中矿质元素的相关关系、产地溯源影响控制等方面的认识仍十分有限。此外，茶树品种对茶叶地理来源鉴别的影响也尚不清楚。土壤中Si、Al、Fe、Mn、P、K、Na、Ca、Mg、Ti、Cu、Zn元素，在母质发育成壤的地球化学风化过程中有明显的地球化学行为，其在土壤中的含量既能表征土壤地球化学的过程[22-24]，又能被茶树进一步吸收，间接表现不同产地来源的元素的化学含量特征，故而可将土壤、茶叶进行联合分析。在以往的研究模式上，本研究拓展了以土壤-茶叶为体系的多矿质元素产地溯源研究路径，将不同深度下的土壤、土壤-茶叶、茶树品种纳入产地溯源分析，以期为今后贵州名优茶产地矿质元素指纹图谱建设、地区茶产业发展提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

于2019年11月贵州东部(黔东)雷山县、贵州南部(黔南)都匀市、贵州北部(黔北)湄潭县及凤冈县3个地区采集土壤及茶叶样品，其中黔东地区基岩(母质)以变余砂岩为主，土壤为硅铝质黄壤；黔南地区基岩(母质)主要为石英砂岩和白云质砂岩，均风化为砂质黄壤；黔北地区为第四系残积物形成的红色红黏土或红黏土下覆砂质白云岩。以上不同类型基岩各设置3个采样点，共计采集土壤、茶叶样品161份，其中土壤样品以随机采样法，采集植茶年限为20～25年茶园0～100 cm土壤剖面样品85份(间隔20 cm取样)；以一芽二叶的茶叶形态为标准，采集坡顶、坡中、坡底茶叶各200 g，最终合为1份混合茶样，共获得66份混合茶叶样品(福鼎大白30份、毛尖种12份、黔湄种13份、云大种11份)。

1.2 仪器与设备

WGL-65B/WGL-230B电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司；TJZ7836植物样粉碎机，浙江BILON公司；Milli-Q Advantage超纯水仪，美国Millipore公司；AAS原子吸收光谱仪，火焰石墨炉原子吸收光谱仪ZEEnit700，德国耶拿分析仪器有限公司；SHA-B水浴恒温振荡器，青岛明博环保科技有限公司；DB-2AS恒温电热板，常州金坛良友仪器有限公司；尤尼柯7200型紫外分光光度计，美国UNICO公司；TD5.5台式大容量离心机，上海卢湘仪离心机有限公司；Si、Al、Fe、Mn、P、K、Na、Ca、Mg、Ti、Cu、Zn标准液(GSB04-1757-2004国家标准物质)，国家有色金属研究院。

1.3 试验方法

1.3.1 茶叶样品前处理 茶叶样品经去离子水冲洗，烘箱90℃快速杀青后于70～75℃烘干。用植物样粉碎机粉碎，过0.25 mm尼龙网筛，装入聚乙烯样品袋备用。取0.3 g茶叶样品，置于聚氯乙烯高压密闭罐中，加入7.5 mL浓HNO3，静置12 h后装入高压消解聚合反应釜，于烘箱中180℃消解12 h。待完全冷却后取出聚四氟乙烯内衬罐经60℃电热板加热1 h，100℃加热1.5 h，150℃加热1.5 h，随后用5%盐酸溶解并转移聚四氟乙烯内衬罐中样品至25 mL容量瓶中备测。

1.3.2 土壤样品前处理 参照矿质元素全量消解方法[25]，取过筛的0.149 mm土壤样品0.5 g于三角瓶中，依次加入3 mL浓HNO3、5 mL浓HCl、2 mL浓H2SO4进行加热消解，待样品呈白色粘稠状取下。用近沸1 mol·L-1HCl继续加热30 min后转移至离心管，5 000 r·min-1离心8 min，取上清液于100 mL容量瓶，对离心管中残余物如此反复3轮，以去离子水定容至100 mL，作为Fe、Mn、Al、K、Na、Ti、P、Cu、Zn待测液；Ca、Mg待测液的制备以7.5 mL浓HCl、2.5 mL浓HNO3、5 mL HClO4进行消解，其余浸提操作步骤同上；向三酸(HNO3-HCl-H2SO4)消解后的离心管残余物中加入75 mL预热的0.5 mol·L-1NaOH搅拌浸提20 min，急速冷却后5 000 r·min-1离心8 min，取上清液供测Si。

1.3.3 矿质元素分析 Fe、Ca、Mg、Mn、K、Na、Cu、Zn以原子吸收光谱法测定，Ti采用二胺替比林甲烷法，Si采用硫酸亚铁铵比色法，Al采用二甲酚橙比色法，P采用钼锑抗比色法[25]。

1.4 数据分析与处理

通过SPSS 25软件进行单因素差异性分析，显著性差异元素经事后多重比较分析均方差，以Person相关分析(P<0.05或P<0.01)检验各元素在土壤-茶叶间的相关性。利用因子分析对显著差异性元素进行巴特利特球形验证，以检验样本分类适宜性程度。通过主成分分析(principl component analysis, PCA)进行显著性差异元素指标的初筛选，剔除方差贡献能力小的元素指标。最后以逐步线性判别法(stepwise linear discriminant analysis，SLDA)确定贵州名优茶产地溯源的最终元素指标，建立产地溯源模型，并以严格的留一交叉验证法对所建立的茶叶产地判别模型精准性和稳定性进行预测。判别溯源可视化图像以SPSS分析结果为基础，以Origin 2019软件进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 矿质元素差异特征

2.1.1 产地土壤矿质元素的空间差异 Duncan′s新复极差法表明(表1)，贵州省茶叶主产区(黔东、黔南、黔北)的土壤矿质元素表现出不同深度下的显著性差异(P<0.05或P<0.01)特征。随着土壤剖面由浅及深，显著性差异元素的数量总体上逐渐增多，其中0～20 cm层Al、Fe、Na、K、Mg、Ti、Cu和Zn 8种元素指标呈显著或极显著差异，是显著性差异元素数量最少层；20～40 cm层除Mn和Ca外的其余10种元素在不同产地间均表现出显著性差异；40～60 cm层除Mn外的11种元素在三产地间差异显著，这可能是由于茶树侧根在该层的分布最为密集，茶树根系在矿质元素生理吸收过程中极大主导了元素的分布，土壤元素吸收的化学动力学表现最为活跃；土壤深为60～80 cm时，12种矿质元素含量均具有极显著差异，该土层较深，最接近母质，易受不同产地环境下基岩-母质带的物理风化差异影响，而不易受到施肥影响，更易继承和表现不同母质或基岩的矿质元素背景差异[24]；而当继续深入至80～100 cm层，除Mn外，其余11种元素均呈显著性差异，可能由于该层的母质层或下伏岩石的半风化特性对矿质元素的矿化释放有较大影响。

表1 贵州茶主产区不同土壤深度下矿质元素含量

而以0～100 cm作为土壤剖面的整体分析显示，各茶叶产地矿质元素的含量存在明显地域特征，其中黔东地区Si平均含量最高，Mn、P含量最低；与其他2个地区相比，黔南地区Ca、Al、Fe、Na、K平均含量最低；黔北地区茶园土壤中Al、Fe、Mn、Na、K、P、Cu、Ca平均含量高于黔东和黔南，Si、Ti、Zn平均含量则低于其余两地。

2.1.2 茶叶矿质元素含量特征 对相同产地不同茶树品种，以及不同产地同一茶树品种(即福鼎种)的茶叶元素含量进行单因素方差分析，以探究产地差异及品种差异下的茶叶矿质元素含量特征。结果显示(表2)，黔东地区福鼎种茶叶中Mn、Cu、Zn元素含量显著大于云大种茶叶(P<0.01)，而Ti元素含量显著小于云大种(P<0.01)；黔北地区不同品种茶叶中Mn、Ca、Ti元素含量均表现为福鼎种极显著大于黔湄种(P<0.01)，Zn元素含量极显著小于黔湄种(P<0.01)；黔南地区茶叶中除Cu、Zn外的10种矿质元素含量，在不同品种间(福鼎和毛尖种)均无显著差异。

表2 贵州不同产地品种茶叶矿质元素含量

2.1.3 土壤茶叶间元素含量相关性 将茶园土壤剖面间呈显著性差异的12种矿质元素进行土壤-茶叶成对样本T检验，结果显示茶叶中Si、Fe、Mn、K、Ca、Mg、Cu浓度与不同深度范围下土壤中所对应元素的浓度显著相关(表3)。Si元素含量在近基岩层土深(80～100 cm)与茶叶呈显著相关性，而Fe、Mn、K、Ca、Mg、Cu 6种元素含量总体上(0～100 cm)在土壤-茶叶间表现出极显著相关关系，表明土壤中这6种矿质元素的含量对茶叶中对应元素含量影响更为明显。其中Mn、K、Ca、Mg 4种元素在不同深度土壤-茶叶间，仅一层未表现出显著相关外，其余四层土壤深度下均表现出显著正相关关系。茶叶中某一元素含量与土壤中的含量高度相关，表明茶叶中该元素主要来源于茶树所对应的原产地土壤。Fe、Cu除在80～100 cm土壤深度下与茶叶无显著相关关系外，其余深度下的土壤-茶叶间均为显著负相关关系；而Al、Na、P、Ti、Zn 5种元素在不同深度下的土壤-茶叶间均无显著相关性(P>0.05)，这意味着茶叶中这部分元素浓度可能并不完全取决于土壤中的浓度，大气沉降、有机肥料和化学肥料，茶树生理特性也会影响茶叶中元素的浓度[16]。

表3 不同土深下矿质元素与茶叶对应元素的相关性

2.2 茶叶矿质元素产地溯源

2.2.1 主成分分析(PCA) 为验证不同地区间茶叶分组聚类适宜性，先对3个地区茶叶中元素的含量进行巴特利特球形检验，得出取样适切性量数(Kaiser-Meyer-Olkin, KMO)值为0.753，KMO>0.7说明分组聚类效果较好[26]。将土壤-茶叶间呈显著相关的Fe、Mn、K、Ca、Mg、Cu元素用于不同地区茶叶矿质元素主成分分析，结果表明，前3个主成分占全部方差解释的82.3%。以前3个主成分作3D得分图，结果显示(图1)，3个地区间茶叶矿质元素主成分得分聚类效果较明显，表明来自同一产地间的茶叶元素指纹图谱变异小于不同来源地间的变异程度，黔东和黔南地区仍有部分重叠区域，黔北茶叶可被明显区分开。从空间分散性来看，黔南茶叶分布较散，这可能与黔南植茶区复杂地质背景，以及发育成壤的矿质元素含量异质性有关。

图1 贵州(黔东、黔南、黔北)茶叶前3个主成分的三维散点图

利用PCA分析结合多矿质元素指纹图谱，为茶叶产地溯源指标的筛选提供了一定参考。但从3D空间散点聚类图可知，进行PCA分析的地区间茶叶仍存在较明显的空间重叠区域，此外，PCA分析无法提供溯源判别模型和判别结果的最终量化参数。基于此，利用反向传播(back propagation，BP)神经网络及有监督排序的逐步线性判别法(SLDA)分析，完成对多溯源地区的精准化判别及茶叶产地溯源模型的构建。

2.2.2 不同土深的BP神经网络分析 为明确最适宜于贵州茶叶产地溯源分析的土壤剖面深度，对不同土壤深度下土壤-茶叶间显著性相关元素集、显著性差异元素集分别进行BP神经网络分析。在BP神经网络分析中，将所有茶叶样品的70%作为神经网络的判别训练集，剩余30%作为外部样品检验集。其中，以土壤-茶叶间显著性相关元素集进行分析的结果显示，不同深层土壤中，以60～80 cm土层的验证判别正确率最高，为92.9%，而以显著性差异元素集进行分析的结果显示，基于60～80 cm土层的溯源判别率及验证判别率均最高，为100%。2种元素集下的BP神经网络分析均以60～80 cm层的判别效果最好(表4)。

2.2.3 不同土深的SLDA产地溯源分析 对不同土壤深度下土壤-茶叶间显著性相关元素集、产地间显著性差异元素集分别进行SLDA分析。其中，以不同土壤深度下土壤-茶叶间显著性相关元素集进行SLDA产地判别分析，结果显示(表4)，80～100 cm判别正确率最低，而0～20 cm、20～40 cm、40～60 cm产地判别的正确率均为92%，在严格的留一交叉法验证下其正确率降低为86.4%。在SLDA分析中依次将Fe、K、Mg、Cu、Mn 5种元素输入判别模型，Si、Ca被剔除。由以其构建的茶叶产地判别散点图(图2-b)可知，黔南地区茶叶样本分散性高，与黔东和黔北有极少空间的重叠交互。以显著性差异的不同深层土壤矿质元素分别进行SLDA分析，结果显示(表4)，各层次的初始判别正确率为60～80 cm>0～20 cm>20～40 cm=40～60 cm=80～100 cm；以初始判别率最高的60～80 cm土层的SLDA分析结果显示，Zn、Cu、P、Mn、Fe、Mg、K 7种元素先后被引入到产地溯源模型中，判别正确率高达98.5%，经留一交叉法验证其预测稳定性，其正确率仍可保持在98.5%，说明该判别模型具备强大的准确率及稳定性，结合BP神经网络结果可知，60～80 cm层为最佳产地溯源判别的土壤层。在以其构建的判别模型中，所有茶叶样本的空间散点均可被归类到正确的产地中(图2-d)，其中黔南地区样点最为分散，说明黔南茶叶存在较大的区域内差异。对比以土壤-茶叶间显著性相关元素集所构建的产地判别模型，该方法最终筛选得到的判别元素指标增加了P和Zn元素，构建了更为可靠稳定的茶叶产地判别模型，明显提升了判别准确率。P、Zn的引入说明二者携带了丰富的产地环境信息，可能与P、Zn的土壤地球化学特征及茶树本身的生理特性有关。基于7种矿质元素的贵州名优茶产地判别模型如下：

表4 不同土壤深度下SLDA及BP神经网络法的产地溯源效果对比

图2 不同产地指纹元素筛选池下的SLDA茶叶产地判别分析

黔东=-14.33Fe+5.65P + 10.09K-3.12Mn + 39.41Mg + 54.59Cu + 192.20Zn-139.74;

黔南=2.07Fe + 4.42P + 9.12K-1.71Mn + 32.86Mg + 259.76Cu-1.64Zn-109.01;

黔北=-9.67Fe + 3.31P + 7.50K-0.98Mn-27.35Mg + 108.82Cu + 78.84Zn-71.31。

2.2.4 茶叶品种对产地溯源的影响 为分析评估茶叶品种的溯源影响，分别对来自黔东、黔南、黔北3个地区的6个茶叶品种进行SLDA判别分类。结果显示，不同茶树品种空间重叠明显(图3)，可能是由于不同茶树品种对矿质元素并无明显的特征性吸收。而品种判别结果显示，有92.4%的样品可被正确区分，但经严苛的交叉验证后判别正确率仅为75.8%，品种判别正确率明显低于茶叶产地溯源正确率。虽然整体上难以对茶叶品种进行区分，但所有来自相同产地的茶叶样品都具有极为明显的地域聚类趋势；同时留一交叉验证结果显示，尽管有些样本判别分类有误，但各产地各品种茶叶样本几乎都判别到其真实的产地区域，而被错误分类的茶叶样本，也几乎都归类到同一产地来源的其他茶叶品种中，说明茶叶的产地地理溯源几乎不受茶树品种的影响。

注：1：福鼎；2：云大；3：毛尖种；4：福鼎；5：黔湄；6：福鼎。

3 讨论

现有的茶叶产地溯源研究大多仅以茶叶本身为载体，研究对象较为单一。宋向飞[27]以茶叶中所含的Fe、Mg、Ca、Al 作为碧螺春茶叶产地的元素溯源指标，对2个目标产地的判别正确率为98.1%；石伊凡等[19]以Mg、Cr、茶多酚等多个矿质元素及生化成分法对龙井茶产地进行溯源，其鉴别准确率保持在80%以上。而以土壤联合植源性农产品进行产地溯源的研究极少，仅有赵海燕[28]曾对来自河南、河北省的小麦及表层土壤(0～40 cm)进行分析，以筛选的Na、Mn、Cd、Sn、Ba元素建立了小麦产区溯源函数模型，其鉴别准确率为94.45%。本研究通过0～100 cm茶园土壤剖面分析，发现各茶叶产地矿质元素的含量存在明显地域特征，这种地区间元素差异特征可能是由地域间不同元素背景值、成土母质、气候及地形等环境因素综合作用下的土壤发育和风化程度所致[23]。而前人研究也表明，不同基岩或母质发育成壤的矿质元素含量差异导致了不同地域来源植物中元素含量的差异[23,29]。而本研究通过对不同深度土壤与茶叶联合溯源的探究显示，土壤-茶叶产地溯源的最佳土壤层为60～80 cm层，其产地验证判别的正确率可达100%(BP神经网络法)和98.5%(SLDA法)，0～20 cm表层土壤次之，为98.1%(BP神经网络法)和92.4%(SLDA法)，这可能是由于0～20 cm层土壤易受施肥等管理措施影响，而60～80 cm层土壤更易承袭母质特性，矿质元素得以保留更为原始的产地地域信息。

值得注意的是，用于茶叶产地溯源的矿质元素，并非完全来自土壤与茶叶间的显著性相关元素，更多是来自地区间土壤显著性差异元素，如判别模型中的P和Zn。茶树强烈吸收P、Zn是影响茶叶品质的关键因子，其含量对Fe、Ca、Mg、Mn、K、Na的吸收有显著影响[30-31]。不同基岩发育土壤中P组分含量差异明显[32]，故而本研究采集的不同地理来源的基岩-土壤-茶叶样品体系中P组分含量差异特征可能携带了重要的产地鉴别信息。此外，张徐杨等[33]从Zn转运蛋白基因表达的角度验证了土壤中不同水平的Mn元素含量显著影响茶叶中Zn的含量，而本研究发现黔东、黔南、黔北土壤、茶叶中Mn含量互呈显著差异，这为不同产区茶叶中Zn含量所表现出的差异性提供了解释。以土壤显著性差异元素集作为茶叶产地判别指标更为可靠，其产地鉴别正确率达到100%(BP神经网络法)和98.5%(SLDA法)，这表明不同产地的茶叶较好地继承了土壤矿质元素的差异特征，在茶树生长地域的地质背景、气候环境、土壤理化性质等因素共同作用下，形成了土壤矿质元素的地域性丰度特征，从而为矿质元素产地溯源提供了判别信息。因此，以土壤-茶叶为体系进行分析，有利于进一步探究产地溯源的矿质元素信息成因。

茶叶品种差异是否会影响产地溯源判别是需要明确的溯源关键[34]。本研究对3个产地6个不同茶树品种的产地溯源研究表明，茶叶品种对产地鉴别溯源并无明显影响，而此前Damak等[35]对橄榄油、赵海燕等[36]对小麦产地溯源的研究也得出了类似结论。茶树品种主要影响的是茶叶中的有机成分，如茶多酚、氨基酸和咖啡因等品质指标[16]。此外，前人研究表明，茶叶中稳定同位素(如C、H、O和N)与矿物质多元素结合可有效地追溯茶叶产地[14,37]。一些新的多元统计工具，如决策树[38]、支持向量机[39]、K近邻分析[40]，也已成功用于鉴定植源性农产品产地，这些新的多元统计模型和茶叶中的稳定同位素指纹技术可用于今后对茶叶产地的溯源研究。本研究虽提供了一种以不同深层土壤与茶叶为对象的产地溯源方法，但仅对贵州名优茶产地(黔东、黔南、黔北地区)进行了初步研究，生产实际中的普适性还需以多个地区及大量的样本为支撑。此外，在今后研究中还需注意对不同季节、土壤类型、炒茶工艺等因素进行研究，以建立更为精准、稳定、可靠、实用的茶叶产地判别模型。

4 结论

本研究在前人产地溯源研究的基础上，发展了以不同深层土壤结合茶叶多矿质元素特征的产地溯源方式。结果表明，基于BP神经网络和SLDA的贵州名优茶产地溯源结果最优。在不同深层的土壤-茶叶系统中，以60～80 cm土壤-茶叶的产地溯源效果最优，Zn、Cu、P、Mn、Fe、Mg、K 共同构成了贵州名优茶产地溯源信息指标，以上述7种矿质元素构建的产地溯源模型，判别正确率及交叉验证率均达98.5%。同时，验证结果表明茶树品种对茶叶地理产地的追踪无明显影响。