鲜切莲藕复合保鲜剂的优化及保鲜效果研究

魏舒楠 韩延超 刘瑞玲 陈杭君 郜海燕

(浙江省农业科学院食品科学研究所/农业农村部果品产后处理重点实验室/浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室/中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室，浙江 杭州 310021)

莲藕(NelumbonuciferaGaertn)是在我国广泛种植的特色水生蔬菜，具有很高的营养价值[1]。鲜切莲藕食用方便，较整根莲藕带泥销售更具市场竞争力。但鲜切莲藕在加工、运输、贮藏等过程中易发生酶促褐变及微生物污染，使产品的感官及营养品质急剧下降，限制其流通及销售。近年来，短波紫外线[2]、酸性电解水[3]等一些新兴的非热杀菌方式均在鲜切莲藕中开展了研究应用，然而以上方式存在生产者使用度不高、营养品质流失较快[4-5]等问题。因此，研究各种化学或天然物质对鲜切产品的保鲜效果，开发高效安全、操作简便的保鲜技术，一直是国内外研究的热点。利用黄原胶等天然成膜剂对鲜切莲藕涂膜处理可以抑制其表面水分散失和呼吸作用的加快，但单独使用对其抗菌和抑制褐变作用无显著效果，因此常与天然或化学保鲜剂结合使用[6-9]。

氯化钙(calcium chloride，CaCl2)是一种绿色环保的保鲜剂，可作为抗褐变剂加入多糖涂膜，抑制褐变相关酶的活性，对鲜切苹果[7-8]、枣[10]等保鲜效果显著。通过熏蒸、浸泡乙醇(ethanol，EtOH)等方式保鲜西兰花[11]、生菜[12]、荸荠[13]、甘蔗[14]等鲜切产品，可使产品维持较好的品质。天然物质阿魏酸(ferulic acid，FA)可以通过参与鲜切荸荠的苯丙氨酸代谢途径抑制酚类物质的合成，从而有效延缓褐变[15]。此外，FA具有良好的抑菌性能，能有效控制采后番茄青霉病和苹果灰霉病的发生[16-17]。研究表明，使用复合保鲜剂对鲜切产品的保鲜效果比单独使用保鲜剂的效果更好[15, 18]，然而目前还没有将三者复合应用于保鲜鲜切产品的研究。基于此，本试验以鲜切莲藕为原料，在单因素试验的基础上，采用响应面设计法，探讨CaCl2、EtOH和FA复合处理对鲜切莲藕的护色及品质影响，筛选出最佳配方后通过测定相关指标验证保鲜效果，旨在提高鲜切莲藕的品质，同时为氯化钙、阿魏酸和乙醇在果蔬保鲜领域的联合应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

莲藕：鄂莲五号，采自浙江杭州湾里糖莲藕专业合作社，采后暂存于含有冰袋的泡沫纸箱，1 h内运回实验室，于4℃条件下预冷24 h，选取藕节粗壮、大小一致、无机械损伤和病虫害的中间部位。

主要试剂：无水乙醇、氯化钙、阿魏酸、三氯乙酸、磷酸、邻菲罗啉、福林酚、碳酸钠、三氯化铁、抗坏血酸、甲醇、盐酸(均为分析纯)，上海凌峰化学试剂有限公司；没食子酸标准品、抗坏血酸标准品(均为色谱纯级)，上海源叶生物科技有限公司；平板计数琼脂培养基(PCA)，上海盛思生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

果蔬切片机，德清拜杰电器有限公司；TA.XT.Plus物性测定质构仪，英国Stable MicroSystem公司；CR-400手持色差仪，日本KONI-CAMINOLTA公司；PAL-1手持型折光仪，日本ATAGO公司；UV-9000紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；SCIENTZ-12N冷冻干燥机，宁波新芝冻干设备股份有限公司；TM 3000扫描电镜，日本日立公司；恒温恒湿箱，日本SANYO公司；MLS-3781L-PC高压蒸汽灭菌器，松下健康医疗器械株式会社；MJX-160B-Z细菌培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-2FD超净工作台，江苏苏净集团有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试验处理 将去泥莲藕于200 μL·L-1次氯酸钠溶液中浸泡2 min，用清水冲洗并晾干。去皮后用切片机切分为4 mm薄片，分别用无菌水配制的保鲜剂溶液及无菌水(对照组)浸泡10 min，沥干后分装于0.04 mm PE袋中，每袋60±3 g，每组3个重复。置于温度4℃、相对湿度75%的恒温恒湿箱中。

1.3.2 单因素试验设计 前期预试验通过微生物评价及表观、失水等主要感官评定，选取氯化钙质量分数(m/m)(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)、阿魏酸质量分数(m/m)(0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%)、乙醇体积分数(v/v)(5%、10%、15%、20%、25%)进行单因素试验，测定不同处理组鲜切莲藕相关品质，6 d取一次样，取至12 d。

1.3.3 响应面试验设计及回归模型验证 根据Box-Behnken设计原理[19]，在单因素试验基础上，以贮藏末期ΔE*值(R1)、失重率(R2)和菌落总数(R3)为响应值，对氯化钙、阿魏酸和乙醇复合配方进行优化，评价鲜切莲藕综合质量。因素水平如表1。

表1 响应面试验因素水平表

1.4 指标测定

1.4.1 色泽测定 采用CR-400色差仪测定鲜切莲藕无孔处L*、a*、b*值，根据下式计算样品的总容差ΔE*[2]：

(1)

式中，ΔL*、Δa*、Δb*分别表示样品测定时的L*、a*、b*值与初始测定值之差，ΔE*代表总体色差变化，其值可以反映样品的褐变程度[20]。

1.4.2 失重率测定 参照周志强等[9]的方法测定，根据下式计算失重率：

(2)

式中，m0为初始鲜切莲藕的质量，g；mn为第n天的质量，g。

1.4.3 可溶性固形物含量(soluble solid content，SSC)测定 随机取3～4片莲藕，控制取样量约20 g后将其磨碎，使用3层纱布挤出汁液并滴至PAL-1手持式折光仪上进行读数，结果以%表示。

1.4.4 硬度测定 参照张翰卿等[21]的方法，选择两次咀嚼(texture profile analysis, TPA)模式并使用P6探头。具体参数设定如下：测前速度、测试速度和测后速度分别为1、1和3 mm·s-1，深度为3 mm，单位为N。

1.4.5 微生物评价 参照《GB 4789.2-2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[22]的方法。

1.4.6 可溶性醌及总酚含量测定 可溶性醌测定参照王梦丽[23]的方法并略作调整。称取0.5 g冻样加入5 mL 1%(v/v)的盐酸-甲醇溶液浸提，于4℃、4 000 r·min-1条件下离心10 min并吸取上清液，在437 nm处测定其吸光值，结果用ΔOD437nm·g-1表示。总酚含量参考杨莹等[24]的方法并稍作调整，以没食子酸标准品制作标准曲线，单位为mg·100 g-1。

1.4.7 扫描电镜观察 参照Lara等[25]的方法并略作调整。在无菌环境下将鲜样切分为1 mm3块状组织并于-80℃下预冻24 h，临界点干燥后喷金，观察并拍摄500倍的电镜图片。

1.4.8 抗坏血酸含量测定 参照曹建康等[26]的方法，采用分光光度计法并稍作修改。以抗坏血酸标准品制作标准曲线后计算抗坏血酸含量，单位为mg·100 g-1。

1.5 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 氯化钙质量分数对鲜切莲藕品质的影响ΔE*值表示总色差的变化程度，是鲜切莲藕褐变程度的指标性参数[3]。表2数据表明适宜质量分数的CaCl2浸泡可有效保持切面色泽，其中0.6% CaCl2处理后ΔE*值始终维持较低水平，6、12 d分别为6.80和9.00，1.0% CaCl2会加快ΔE*值升高。SSC、硬度和失重率的变化可以反映鲜切莲藕贮藏过程中营养物质消耗、组织软化及水分丧失的进程。贮藏末期，0.6% CaCl2处理组SSC含量为5.33%，显著高于其他处理组(P<0.05)。鲜切莲藕的硬度随贮藏时间的延长而下降，CaCl2可将其硬度维持在较高水平。12 d时0.6% CaCl2处理组硬度为42.04 N，是对照组的1.33倍(P<0.05)。水分和营养物质流失使鲜切莲藕的失重率不断上升，贮藏末期对照组和1.0% CaCl2处理组的失重率分别为4.88%和5.52%，出现明显的皱缩现象。0.6%的CaCl2处理最为有效地延缓了鲜切莲藕失重率的升高。

表2 氯化钙质量分数对鲜切莲藕贮藏期内的品质变化影响

2.1.2 阿魏酸质量分数对鲜切莲藕品质的影响 由表3可知，相比于对照组，贮藏末期各FA处理组均可显著抑制鲜切莲藕ΔE*值上升(P<0.05)。质量分数为0.15%、0.20%的FA处理较好地抑制了莲藕切面的褐变，但两者之间无显著差异(P>0.05)。FA处理可以减缓淀粉等营养物质的消耗，抑制SSC下降。对照组硬度在贮藏期间下降最快，0.15% FA处理后鲜切莲藕的硬度始终保持较高水平，贮藏末期为48.24 N，是对照组硬度的1.46倍。FA处理后失重率变化小，所有处理组与对照组均呈现显著差异(P<0.05)。贮藏末期，0.15% FA处理组失重率仅为对照组的46.18%。

表3 阿魏酸质量分数对鲜切莲藕贮藏期内的品质变化影响

2.1.3 乙醇体积分数对鲜切莲藕品质的影响 由表4可知，贮藏末期5% EtOH处理组ΔE*与对照组无显著差异(P>0.05)，结合感官观察结果，高浓度乙醇(20%、25%)处理虽可将ΔE*控制在低水平，但贮藏后期莲藕表面失水严重且伴随发酵散发出的酒味、霉味，已失去商品价值。相比之下15% EtOH处理组贮藏末期ΔE*低至10.23且始终无异味产生，保证了鲜切莲藕的感官品质。20%、25% EtOH处理组SSC含量降低最快，可能是高浓度乙醇诱发了鲜切莲藕的无氧呼吸，加速底物消耗。与这两组相比，其他浓度处理后SSC下降缓慢。15% EtOH处理组在12 d时硬度最大，为49.74 N，是对照组的1.66倍。经分析，25% EtOH处理组失重率始终处于最高，表面水渍、干皱现象明显。贮藏12 d时，15% EtOH处理组鲜切莲藕失重率为3.06%，分别为对照组和25% EtOH处理组的69.07%、61.69%。

表4 乙醇体积分数对鲜切莲藕贮藏期内的品质变化影响

综上，将0.6% CaCl2、0.15% FA、15% EtOH作为下一步响应面试验设计的中心点。

2.2 响应面优化结果分析

2.2.1 建立二次多项式回归模型及显著性分析 利用Design Expert 10.0.7软件进行试验设计，以鲜切莲藕贮藏12 d的ΔE*(R1)、失重率(R2)和菌落总数(R3)为响应值，设计15个试验点，中心点试验重复设计3次。试验结果如表5所示。通过对结果进行回归拟合，得到3个响应值分别对应的二次多项回归方程如下：

表5 Box-Behnken试验设计与结果

Y1=+8.12+0.28A-0.29B-0.30C+0.37AB+1.05AC+0.62BC+0.22A2+1.63B2+2.33C2

Y2=+2.84-0.11A-0.01B+0.03C+0.03AB-0.02AC+0.01BC+0.10A2+0.05B2+0.04C2

Y3=+7.90-0.26A-0.50B-0.18C-0.14AB-0.49AC-0.09BC+0.15A2-0.33B2+0.15C2

式中，Y1、Y2、Y3分别为ΔE*、失重率和菌落总数的回归方程，A、B、C分别为氯化钙、阿魏酸质量分数和乙醇体积分数。

表6 响应面回归模型方差分析结果

2.2.2 响应面交互作用分析Y1、Y2、Y3方程中二次项系数均为正值，抛物面开口向上，方程有最小解。图1、2、3分别代表各因素与模型1(ΔE*，R1)、模型2(失重率，R2)、模型3(菌落总数，R3)的交互作用。模型1(ΔE*，R1)中交互项AC在P<0.05水平上显著，与之对应，响应曲面图显示CaCl2和EtOH的交互影响在曲面中表现为坡度较陡且等高线呈椭圆形，各因素对鲜切莲藕色泽影响的高低顺序为EtOH>FA>CaCl2；模型2、3中交互项AB、AC分别在P<0.05、P<0.01水平显著且影响顺序分别为CaCl2≫EtOH>FA，FA>CaCl2>EtOH，说明各保鲜剂对响应值的影响不是简单的线性关系且相互之间具有协同作用。

图1 氯化钙、阿魏酸、乙醇处理对鲜切莲藕ΔE*的响应面图

2.3 最佳工艺确定及保鲜效果验证

2.3.1 验证实验 综合分析3个拟合模型，预测最佳配比为氯化钙质量分数0.68%，阿魏酸质量分数0.18%，乙醇体积分数14.84%。考虑实际操作的可行性，将乙醇体积分数调整为15%。该条件下响应值预测结果为ΔE*值8.83，失重率2.84%，菌落总数7.33 lg(CFU·g-1)，模型可信度达96%。用调整后的工艺条件进行验证，结果显示鲜切莲藕12 d的ΔE*值为8.64±0.42，失重率为2.85%±0.28%，菌落总数为7.26±0.10 lg(CFU·g-1)，经计算各实际值与预测值之间相对偏差均小于5%，表明响应面设计最佳条件可靠，回归模型建立有效。同时由图4可知，对照组贮藏末期ΔE*值为20.86±0.18，为复合处理组的2.41倍，复合处理组极显著抑制了切面色泽加深(P<0.01)，此外，对照组的失重率为5.50%±1.03%，菌落总数高达9.33±0.09 lg(CFU·g-1)，均高于复合处理组。因此，该复合保鲜剂对维持鲜切莲藕贮藏期内关键品质有显著效果且三者复合较单一处理效果更好。

图2 氯化钙、阿魏酸、乙醇处理对鲜切莲藕失重率的响应面图

图3 氯化钙、阿魏酸、乙醇处理对鲜切莲藕菌落总数的响应面图

图4 验证实验图

2.3.2 硬度及SSC含量 如图5-A所示，对照组的硬度下降更快且值更低，经复合处理后，鲜切莲藕硬度下降幅度小于对照，贮藏12 d时为39.29 N，是对照组的1.04倍。图5-B中，对照组自贮藏中期(6d)起均显著低于复合处理组(P<0.05)，可见复合处理对鲜切莲藕SSC的保持有显著效果。

图5 不同处理对鲜切莲藕硬度(A)及SSC(B)变化

2.3.3 扫描电镜观察 图6为不同处理条件下鲜切莲藕样品贮藏0、6和12 d的微观结构。贮藏6 d时，对照组淀粉迅速降解，细胞壁表面开始松软坍塌，而处理组细胞壁破损程度轻且淀粉颗粒形态完好，大小均一。贮藏12 d时，对照组样品细胞壁变形破裂，淀粉颗粒损害严重。处理组细胞壁蜂房结构明显且完整，淀粉颗粒虽变得松散，数量依旧较多。

注：a代表第0天; b,c为对照组; d,e为复合处理组。

2.3.4 可溶性醌、总酚和抗坏血酸含量 酚类物质是莲藕酶促褐变的底物，可溶性醌则为酶促褐变的中间产物，因此研究总酚和可溶性醌含量对酶促褐变的研究有重要意义。如表7所示，随着贮藏时间的延长，总酚含量在两组间整体呈下降趋势。贮藏8 d起，对照组总酚含量显著低于处理组(P<0.05)，随着褐变的加深和营养物质的流失，鲜切莲藕代谢过程减慢，而复合处理能够维持多酚物质含量。复合处理组在贮藏全期显著抑制可溶性醌含量升高(P<0.05)，表明复合处理可显著延缓酶促褐变的发生，保持其商业价值。抗坏血酸含量随贮藏时间的延长整体呈现逐渐下降趋势，经处理后的鲜切莲藕抗坏血酸含量变化缓慢，贮藏末期高达对照组的2.6倍。

表7 不同处理组贮藏期内各指标的比较

3 讨论

本研究利用响应面法优化出了一种CaCl2、阿魏酸和乙醇复配处理鲜切莲藕的保鲜剂，三者具有协同增效作用。近年来，学者们开展了三者单独或与其他保鲜剂复合使用的研究，发现不同果蔬的最适剂量范围不同，4% CaCl2水溶液是维持香蕉[28]、苹果[29]品质的最佳浓度，1.0% CaCl2溶液是维持鲜切桃[30]品质的最佳浓度。外源Ca2+在保护细胞结构完整、维持功能正常及调节体内代谢方面起重要作用[31]。然而在本研究单因素试验中，1.0%的CaCl2反而会产生毒害作用，加速鲜切莲藕的褐变进程。这可能是由于过高的Ca2+浓度激活了机体第二信使系统，促进了褐变相关酶活增加，最终引起膜过氧化[32]。乙醇在鲜切果蔬的应用上同样存在剂量效应。适宜浓度乙醇处理可抑制鲜切果蔬的呼吸作用，增强其抗氧化、抗菌能力[12]，但过低或过高的浓度则无保鲜效果甚至会加速衰败。如Chervin等[33]发现高浓度乙醇会促进无氧呼吸途径，产生醇、醛等不利于风味保持的物质。本研究中，5%体积分数的乙醇对鲜切莲藕的感官品质影响不显著，20%及以上体积分数的乙醇处理虽可抑制褐变，但会加剧失重率和SSC变化，表面皱缩失水且伴随浓烈酒霉味。Gao等[34]发现，20%～30%体积分数的乙醇与30 g·L-1的抗坏血酸结合浸泡后，再利用气调包装，可有效抑制鲜切莲藕的褐变。其中最适乙醇的体积分数与本试验结果存在差异，可能是他们针对性研究褐变，而没有考虑综合感官因素的原因。近年来，阿魏酸对果蔬的抑菌作用备受学者关注[16-17]。比较本研究中响应面模型的F值可知，阿魏酸对防止微生物污染的效果最为显著。也有学者研究阿魏酸的护色作用，如Sukhonthara等[35]用阿魏酸处理马铃薯和苹果泥后发现其可有效维持两者色泽。此外，阿魏酸还具有清除自由基及调节细胞防御机制的功能[36]。综上，阿魏酸有望成为安全高效的新型添加剂。

鲜切莲藕色泽加深主要由酶促褐变引起。切分破坏了酚-酚酶区室化分布，酚类物质被氧化成醌，醌类物质聚合成深色物质是酶促褐变的主要原因[3, 20]。因此，褐变与细胞结构损伤、抗氧化能力下降及酚类物质代谢紧密相关。Lara等[25]通过扫描电镜观察发现，经传统抗褐变剂柠檬酸浸泡后的鲜切莲藕细胞壁受损严重、淀粉颗粒降解完全。而本研究的复合保鲜剂可有效维持贮藏期内莲藕的细胞壁结构，还能延缓抗坏血酸含量下降。作为一种抗氧化剂，本研究复合保鲜剂的还原性可以消耗莲藕体内的活性氧，抑制酚类物质氧化和醌类物质的积累[37]。夏天龙等[38]通过感官评定确定鲜切莲藕产品为消费者所接受的微生物约7.00 lg(CFU·g-1)。而本试验中，经过复合保鲜剂处理的鲜切莲藕贮藏12 d后，其菌落总数依旧在可接受范围内，且比对照组少2个对数值。综上，本研究的复合保鲜剂能有效抑制鲜切莲藕褐变、失水和微生物污染，同时维持其贮藏期内品质。

4 结论

本研究建立的复合保鲜剂配比参数与鲜切莲藕贮藏末期总容差ΔE*、失重率和菌落总数的回归模型均有效，经工艺修正后，复合保鲜剂的最优配比为0.68%(质量分数，下同)的CaCl2+0.18%的阿魏酸+15%(体积分数)的乙醇。该条件处理鲜切莲藕并贮藏12 d后的ΔE*为8.64，失重率和菌落总数分别为2.85%、7.26 lg(CFU·g-1)，可明显改善主要存在的褐变、失水及微生物污染问题；同时，该处理延缓了硬度、SSC、总酚及抗坏血酸的下降和淀粉的降解。与同时期对照组相比，微观结构较为完整，且抑制了褐变中间产物可溶性醌的积累。综上，该复合保鲜剂能有效维持鲜切莲藕的品质，但有关其保鲜作用机制还有待进一步深入研究。