不同除草剂对转Bar基因马铃薯田间杂草的防效及安全性分析

贾小霞 马 胜 齐恩芳 吕和平 刘 石 黄 伟 李 掌 曲亚英

(1甘肃省农业科学院马铃薯研究所/甘肃省马铃薯种质资源创新工程实验室，甘肃 兰州 730070;2国家种质资源渭源观测实验站，甘肃 渭源 748201)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)营养丰富，用途广泛，不仅关系粮食安全，而且是解决贫困的支柱产业[1]。近年来，随着国家马铃薯“主粮化”战略的推进，其在我国农业经济中的地位更加突出，种植面积不断扩大。然而，随着马铃薯大面积规模化种植，杂草防治成为马铃薯生产面临的一个重要问题[2]。由于人工除草劳动强度大、成本高，施用除草剂已成为各国马铃薯生产的一项重要除草措施[3-4]。目前，常用的马铃薯专用除草剂有二甲戊灵、乙草胺、精异丙甲草胺等苗前土壤处理剂和嗪草酮、砜嘧磺隆、精喹禾灵等茎叶处理剂[5]。但土壤处理剂受环境因素影响较大，而且不能见草施药，在用药上存在很大的局限性和盲目性，药效较难保证[6]；茎叶处理剂均为选择性除草剂，每种除草剂只对少数杂草有效，没有兼除多种杂草的作用，除草效率低、成本高[7]。广谱灭生性除草剂杀草谱广，除草效率高，但容易对作物产生药害，往往导致植株变态，甚至死亡、绝产绝收，造成巨大的经济损失[8]。因此，培育抗广谱灭生性除草剂的马铃薯新品种一直是各国育种工作者的努力方向之一[9]，转基因技术为这一目标的实现提供了有效途径。

生产上大面积应用的广谱灭生性除草剂——草铵膦，作用靶标是植物氮代谢中的关键酶——谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)[10]。Bar基因来源于土壤吸水链霉菌，其编码的膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinothricin acetyhransferase，PAT)蛋白可使草铵膦的自由氨基乙酰化而失去对GS活性的抑制作用，表现出草铵膦抗性[11]，该基因已成功转入水稻[12]、油菜[13]、小麦[14]等多种作物，且自1999年美国批准转Bar基因水稻LLRICE06和LLRICE62商业化种植以来，已有多个转Bar基因水稻品种被美国、加拿大、俄罗斯等多个国家批准食用和饲用，带来了巨大的经济和社会效益[15]。然而人们担心草铵膦的作用靶标单一，在抗性作物连作时容易诱导杂草产生抗药性，可能产生超级杂草。常规除草剂在抗草铵膦等转基因马铃薯田的合理使用可以有效延缓和治理抗性杂草的产生，因此，检测转基因抗除草剂马铃薯对非靶标除草剂的敏感性及其安全性具有重要的理论和实践意义。

在马铃薯转基因研究中，已有多项研究以Bar基因作为筛选标记筛选阳性转化材料[16-17]，但关于所选材料的除草剂抗性研究鲜见报道。前期，甘肃省农业科学院马铃薯研究所种质资源与生物技术研究室采用根癌农杆菌介导法，将含有Bar基因和抗逆转录因子DREB1A基因的植物表达载体转入多个陇薯系列马铃薯品种中[18]，经抗性筛选获得了具有稳定草铵膦抗性的马铃薯材料[19-20]。随着我国产业结构和转基因监管政策的调整，转基因耐广谱灭生性除草剂作物的推广种植可能将是我国农业生产的必然选择和确保我国粮食安全的战略需求[21-22]。为了明确转基因抗草铵膦马铃薯环境释放的安全性，有必要对抗性材料进行靶标、非靶标除草剂及环境安全性评价。因此，本研究以转Bar基因马铃薯为研究材料，在田间对靶标除草剂草铵膦和非靶标除草剂草甘膦、灭草松、11%砜嘧磺隆·精喹禾灵的杂草防效及安全性进行评价，旨在为转Bar基因抗草铵膦马铃薯的商业化种植提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

转Bar基因马铃薯材料由甘肃省农业科学院马铃薯研究所种质资源与生物技术研究室提供。供试41%草甘膦异丙胺盐水剂，由美国孟山都公司生产；供试480 g·L-1灭草松和11%砜嘧磺隆·精喹禾灵可分散油悬浮剂，由山东中禾化学有限公司生产；供试10%草铵膦水剂和HD400背负式电动喷雾器(药剂喷施器具)，由河北威远生化农药有限公司生产，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 试验设计

试验于2019年在甘肃省农业科学院兰州试验地隔离区进行。试验共设6个处理，即于马铃薯出苗后20 d时，分别将推荐剂量为中剂量的草甘膦，推荐剂量为高剂量的灭草松、11%砜嘧磺隆·精喹禾灵可分散油悬浮剂和草铵膦加入450 kg·hm-2的自来水中(表1)，混匀后按小区定向茎叶喷施田间杂草。每个处理3次重复，采用随机区组排列，小区面积16 m2，行距60 cm，株距33 cm，小区间设1 m的隔离带。

表1 除草剂组分及有效成分含量

1.3 测定指标与方法

1.3.1 除草剂对马铃薯药害和对杂草的防效调查 分别于药后7和14 d，肉眼观察马铃薯表型，观察除草剂是否对马铃薯造成药害，如有药害发生，药害症状和药害级别参照余桂容等[23]的方法进行描述。分别于药后30和45 d，调查除草剂对杂草的防效，调查方法和防效计算均参照贾小霞等[19]的方法。

1.3.2 马铃薯生长指标测定 喷施除草剂后30和45 d时，每小区按对角线选择6株马铃薯，测量株高、茎粗和根茎叶鲜干重。采用卷尺测量株高，即植株地上茎基部到生长点的高度(cm)；采用数显游标卡尺紧贴土壤层从植株的正面和侧面两个方向测量茎直径，用平均值表示植株的茎粗(mm)[24]；用电子称测定根茎叶鲜干重(g)，即采挖整株马铃薯，测完鲜重(g)后，于105℃杀青30 min，80℃烘至恒重后，测定干重(g)。

1.3.3 成熟期马铃薯产量、品质和除草剂残留测定 成熟期(10月8日)，每小区按对角线收获6株马铃薯，同时收集根际土壤测定除草剂残留。收获的块茎混合测定产量后求平均值计算株平均产量(g)，然后用清水冲洗表面泥土等杂质，一部分用于淀粉、干物质、粗蛋白、还原糖和维生素C等品质性状含量的测定，一部分用于除草剂残留的测定。

品质相关指标都参照食品安全国家标准测定，其中淀粉含量参照NY/T 11-1985[25]采用旋光法测定；干物质含量参照GB 5009.3-2016[26]采用直接干燥法测定；粗蛋白含量参照GB 5009.5-2016[27]采用凯氏定氮法测定；还原糖含量参照 GB/T 5009.7-2016[28]采用直接滴定法测定；维生素C含量参照 GB/5009.86-2016[29]采用荧光法测定。马铃薯块茎和土壤中的草铵膦残留参照GB 23200.108-2018[30]采用液相色谱质谱联用(liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS)法检测，灭草松、砜嘧磺隆和精喹禾灵均参照BS EN 15662∶2018[31]采用LC-MS法检测。

1.4 数据分析

原始数据采用 Microsoft Office Excel 2010整理分析；采用DPSV 3.01软件进行单因素方差(one-way analysis，ANOVA)统计分析；差异显著性采用Duncan’s 法分析。所有数据均为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 不同除草剂处理下马铃薯药害分析

由表2可知，施药后7和14 d时，T1、T2、T3和T4处理区马铃薯生长正常，与清水对照(CK)一致，无药害症状出现；而T5处理区马铃薯受害严重，施药后7 d时茎叶萎蔫黄化，14 d时植株全部干枯死亡。由于施药后14 d时T5处理区马铃薯全部死亡，因此，后续试验不对其进行分析。

表2 喷施不同除草剂7和14 d时转Bar基因马铃薯药害统计

2.2 不同除草剂对转Bar基因马铃薯生长的影响

施药后30和45 d时，各药剂处理区和对照区马铃薯一样，都能正常生长，表型上没有出现任何不良反应，说明试验剂量的药剂对马铃薯没有产生明显药害。由表3可知，药后30 d，不同处理区的马铃薯各生长指标差异较大，各处理的平均株高为56.18～63.74 cm，其中T4与T3处理的平均株高无显著差异，但T4处理的平均株高显著高于T2、T1和CK；平均茎直径为9.23～10.03 mm，其中T4、T3和T2处理间无显著差异，但显著高于CK和T1，且CK与T1无显著差异；根茎叶平均株鲜重为187.61～240.17 g，其中T4显著高于T3和其他处理，T3显著高于T2、T1和CK，T2、T1和CK间无显著差异；根茎叶平均株干重为19.24～28.04 g，其中T4显著高于其他处理，T3显著高于T2、T1和CK，T2显著高于CK，T1与CK间无显著差异。

表3 施药后30 d时不同除草剂对抗草铵膦马铃薯生长的影响

由表4可知，药后45 d，各处理的平均株高为60.69～66.21 cm，其中T4与T3之间无显著差异，但显著高于T1和CK；平均茎直径为9.37～11.01 mm，其中T4、T3和T2处理间无显著差异，但显著高于T1和CK，T1与CK间无显著差异；根茎叶平均株鲜重为200.57～267.37 g，其中T4>T3>T2，且各处理间差异显著，T1与CK间无显著差异，但显著低于其他处理；根茎叶平均株干重为21.57～32.34 g，各处理间的差异水平同平均株鲜重。成熟期单株产量从高到低依次为T4>T3>T2>T1>CK，且各处理间的差异均达到显著水平。

表4 施药后45 d时不同除草剂对抗草铵膦马铃薯生长和成熟期单株产量的影响

2.3 不同除草剂对转Bar基因马铃薯块茎营养品质的影响

由表5可知，成熟期各处理马铃薯块茎的平均淀粉含量为15.80%～16.07%，平均粗蛋白含量为2.39%～2.56%，平均还原糖含量为0.46%～0.49%，平均维生素C含量为14.67～15.48 mg·100g-1，平均干物质含量为18.44%～19.15%，各指标在所有处理间有差异，但均未达到显著水平，说明试验剂量的除草剂对转Bar基因马铃薯的块茎营养品质无显著影响。

表5 不同除草剂对马铃薯块茎营养品质的影响

2.4 不同除草剂对转Bar基因马铃薯田间杂草的防治效果

试验田杂草主要有阔叶杂草荠菜(Capsellabursa-pastorisL.Medic.)、苣荬菜(SonchusbrachyotusDC)、灰藜(ChenopodiumglaucumL.)、反枝苋(AmaranthusretroflexusL.)、马齿苋(PortulacaoleraceaL.)和田旋花(ConvolvulusarvensisL.)，禾本科杂草野燕麦(AvenafatuaL.)、狗尾草(SetairaviridisL.Beauv.)、旱稗[Echinochloahispidula(Retz)Nees.]和牛筋草(EleusineindicaL.Gaertn.)。由于杂草种类较多，杂草防效按照阔叶杂草和禾本科杂草两大类进行计算。

如表6所示，药后30 d，T1、T2、T3和T4对阔叶杂草的株防效分别为10.46%、32.22%、58.56%和 86.22%，对禾本科杂草的株防效分别为6.38%、72.06%、84.43%和94.06%；药后45 d，T1、T2、T3和T4对阔叶杂草的株防效分别为19.26%、30.51%、54.39%和82.51%，鲜重防效分别为25.85%、48.27%、64.56%和86.72%；对禾本科杂草的株防效分别为3.87%、70.38%、82.23%和92.38%，鲜重防效分别为4.09%、76.78%、85.01%和92.78%。可以看出，除T1处理对禾本科杂草的株防效和鲜重防效都低于7%外，其他处理对阔叶杂草和禾本科杂草均有明显的防治效果，且两类杂草的株防效和鲜重防效从高到低的顺序一致，都表现为T4>T3>T2>T1，且各处理间的差异均达到极显著水平。

表6 不同除草剂对转基因抗草铵膦马铃薯田间杂草的防治效果

2.5 马铃薯块茎和土壤中除草剂残留分析

由表7可知，成熟期各处理区马铃薯块茎和土壤中灭草松、精喹禾灵、砜嘧磺隆和草铵膦的检测值均小于检测限，检测结果为未检出，表明试验剂量的各药剂均不会产生农药残留危害。

表7 农药残留检测结果

3 讨论

综合考虑除草剂对马铃薯生长安全性及对杂草的防除效果，非靶标除草剂草甘膦(T5)在杀灭杂草的同时，对马铃薯产生了严重药害，致使马铃薯植株干枯死亡、绝产绝收，受害率达100%。草甘膦是一种内吸传导型、非选择灭生性除草剂[32-33]，虽然具有高效、经济的优点，但它对马铃薯同样具有灭杀作用，不能应用于转Bar基因马铃薯田。通过比较各药剂处理下马铃薯的株高、茎粗、植株鲜/干重、单株产量和品质等特性与喷施清水对照(CK)间的差异，发现试验剂量的非靶标除草剂灭草松(T1)、11%砜嘧磺隆·精喹禾灵(T2)以及二者的复配剂(T3)对马铃薯生长过程安全无药害，但各处理对杂草的防效和对马铃薯的增产效果差异较大。当以灭草松和11%砜嘧磺隆·精喹禾灵单独处理转Bar基因马铃薯田间杂草时，灭草松对杂草的防治效果较差，药后30 d，推荐剂量的高剂量(T1)对阔叶和禾本科杂草的株防效分别仅为10.46%和6.38%，虽然马铃薯的前期长势与喷施清水对照(CK)无显著差异，但还是大大减少了对马铃薯养分吸收的影响，成熟期马铃薯单株产量较对照增加了16.87%，这与刘巍等[34]采用有效成分1 440 g·hm-2的灭草松处理普通马铃薯田间杂草时，药后30 d阔叶杂草的株防效为98.17%的研究结果差异较大，这种差异可能是由于不同地区的杂草种类和气候条件差异以及除草剂的使用时间不同所致，仍需进一步研究。本研究中，药后45 d，11%砜嘧磺隆·精喹禾灵的高剂量(T2)对阔叶杂草的株、鲜重防效分别为30.51%和48.27%，对禾本科杂草的株、鲜重防效分别为70.38%和76.78%，马铃薯单株产量较喷施清水对照(CK)增加42.12%，较灭草松单独处理(T1)增加21.61%。11%砜嘧磺隆·精喹禾灵和灭草松的复配剂对杂草的防效显著高于二者单独使用时的防效，药后45 d，推荐剂量高剂量的复配剂(T3)对阔叶杂草的株、鲜重防效较灭草松单独处理(T1)分别提高35.13和38.71个百分点，较11%砜嘧磺隆·精喹禾灵单独处理(T2)分别提高23.88和16.29个百分点；对禾本科杂草的株、鲜重防效较灭草松单独处理(T1)分别提高78.36和80.92个百分点，较11%砜嘧磺隆·精喹禾灵单独处理(T2)分别提高11.85和8.23个百分点；马铃薯单株产量较喷施清水对照(CK)增加58.39%，较灭草松单独处理(T1)增加35.52%，较11%砜嘧磺隆·精喹禾灵单独处理(T2)增加11.44%。综上可知，虽然灭草松、砜嘧磺隆和精喹禾灵已在马铃薯田获得登记应用，但单独处理的杂草防效均不及复配剂，这与吴仁海等[35]的研究结论一致。

通过比较草铵膦处理下马铃薯的株高、茎粗、植株鲜/干重、单株产量和品质等特性与喷施清水对照(CK)间的差异，发现靶标除草剂草铵膦的高剂量对马铃薯生长过程安全无药害，这与贾小霞等[19]的研究结果一致；对阔叶杂草的株、鲜重防效都高于82.51%，对禾本科杂草的株、鲜重防效都高于92.38%，均显著高于T1、T2和T3；单株产量较喷施清水对照(CK)增加67.40%，较灭草松单独处理(T1)增加43.24%，较11%砜嘧磺隆·精喹禾灵单独处理(T2)增加17.79%，较灭草松和11%砜嘧磺隆·精喹禾灵复配剂处理(T3)增加5.6%。相比灭草松和11%砜嘧磺隆·精喹禾灵单独处理，用二者的复配剂与草铵膦轮换防治转Bar基因马铃薯田间杂草，可以达到较理想的防治效果。

从药剂在马铃薯块茎及土壤中的残留分析结果看，各处理马铃薯和土壤中灭草松、精喹禾灵和砜嘧磺隆的检测值均小于0.01，草铵膦在马铃薯和土壤中的检测值均小于0.10，都小于检测限，可以认为不会产生农药残留危害，说明所有处理对薯块和环境都是安全的。

本研究仅选择了靶标除草剂草铵膦和3种非靶标除草剂，只对推荐剂量的高剂量对转Bar基因马铃薯田间杂草的防效及食用和环境安全性进行了分析，而关于这些除草剂更高剂量和其他新型除草剂的使用安全性还有待进一步研究。

4 结论

本研究结果表明，采用草铵膦推荐剂量的高剂量可以高效防治转Bar基因马铃薯田间杂草，减少杂草对马铃薯生长的影响，显著提高生产效率。但为了防止转Bar基因马铃薯连作时，因靶标除草剂草铵膦作用单一而诱导杂草产生草铵膦抗性的风险，建议用有效成分1 440 g·hm-2的灭草松和99 g·hm-211% 砜嘧磺隆·精喹禾灵复配剂与草铵膦轮换防治杂草。