黄瓜耐盐种质资源的筛选与评价

曹齐卫 杜连达 杨宗辉 李利斌 段 曦 杨文强 陈 伟 孟昭娟,*

(1 山东省农业科学院蔬菜研究所/国家蔬菜改良中心山东分中心/山东省设施蔬菜生物学重点实验室/农业农村部黄淮地区蔬菜科学观测实验站(山东)，山东 济南 250100；2 山东农业大学，山东 泰安 271018；3 山东农业工程学院，山东 济南 250100)

黄瓜(CucumissativusL.)是一种重要的经济作物，在世界范围内广泛种植[1]，在我国具有重要的产业地位。连作障碍是当前黄瓜产业发展的瓶颈[2]，其中土壤盐渍化是导致连作障碍的重要原因。连作障碍会导致黄瓜植株生长发育受阻[3]，影响其产量和品质[4]，降低农户收益。因此，从解决盐害的角度出发，筛选培育耐盐碱的黄瓜品种是减少盐害以及利用盐渍化土地种植黄瓜的有效途径之一[5]。

杜长霞等[6]研究发现，在盐胁迫下，黄瓜幼苗的干鲜重明显下降，并且幼苗的茎粗、植株高度、叶片数、叶片面积等生长指标均受到严重抑制。有研究发现在盐胁迫下，光合作用是植株较敏感的生理生化代谢反应[7]，而植株的光合能力下降的主要原因之一是其光合作用所需的色素在盐胁迫下含量降低[8]。盐胁迫下，黄瓜幼苗还会产生一系列的生化指标变化，在NaCl胁迫下会造成黄瓜幼苗的膜质过氧化，细胞膜的相对透性显著增加、结构被破坏，并且叶片中的丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增加[9]，因此MDA含量的积累与膜质过氧化呈正相关，膜质受到盐害程度越高，幼苗中MDA含量越高[10]。当植物受到盐胁迫时往往会表现为缺水状态，这是由于土壤中有盐离子的存在致使渗透失调，外界的水分难以被植物吸收从而使植物因严重缺水死亡。游离脯氨酸和过氧化物酶(peroxidase，POD)作为植物的重要渗透调节物质，在植物体内平衡渗透势。研究表明，在盐胁迫下，黄瓜幼苗内会产生大量的活性氧[11]，而黄瓜幼苗体内的POD、过氧化氢酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等保护酶具有较强的抗氧化性，能够清除活性氧，保护细胞免受氧化损伤[12]。综上所述，在相同的盐胁迫条件下，耐盐黄瓜品种的MDA含量低于敏感品种，而脯氨酸含量和POD活性高于敏感品种[13]。

黄瓜为我国主要栽培蔬菜之一，被广泛种植，生产上面临的土壤盐渍化问题日益显著，而耐盐种质资源较为匮乏。本研究通过测定21份黄瓜材料的耐盐指数、叶绿素、保护酶等各项生理生化指标，筛选出较耐盐黄瓜种质，以期为耐盐品种选育和黄瓜耐盐机理研究提供材料和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

筛选盐浓度所用种质的材料：白黄瓜(M1-2-h-10，海洋白皮高代自交系)、MC2065(新泰密刺改良系)。

21份栽培黄瓜种质材料：华北型材料13份，华南型材料4份，欧美温室型材料3份，欧美加工型材料1份，详见表1。试验种子均由山东省农业科学院提供，栽培基质为瓜果专用固体基质，2021年1月统一种植于山东省农业科学院蔬菜所培养室。

表1 黄瓜材料类型及来源

本试验所用药品均由济南博拓斯生物科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

D3024R台式高速冷冻型微量离心机，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司；HH系列数显恒温水浴锅，江苏科析仪器有限公司；MAPADA P5型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 NaCl胁迫适宜浓度筛选 选取饱满、整齐度一致且无病虫害的黄瓜种子于55℃温水浸泡2 h后置于蒸馏水中，在28℃恒温条件下吸胀12 h。待90%种子露白后，将白黄瓜、MC2065种子播种于固体基质的32孔穴的育苗盘中，置于智能光照培养架上培养。待白黄瓜、MC2065幼苗二叶一心时，分别用0、50、100、150、200、250 mmol·L-1的NaCl处理，每穴浇85 mL盐水，处理3 d后观察黄瓜幼苗表型，计算盐害指数。

1.3.2 黄瓜幼苗NaCl处理方法 半致死NaCl浓度处理21份黄瓜，每个材料每个处理16株，二叶一心时，每株幼苗浇85 mL盐水，3 d后测定形态指标。并取鲜样用液氮冷冻处理置于50 mL试管中，3次重复，-80℃冰箱中保存用于生理生化指标测定。

1.3.3 盐害症状分级标准 盐害症状分级标准参考严勇亮等[14]的方法，并对耐盐性分级标准进行改进，详见图1、表2。

表2 盐害等级划分

图1 叶片盐害等级(第1片真叶)

将得到的数据代入公式，计算盐害指数：

盐害指数=∑(代表级数×株数)/(总株数×最高级数)×100%。

1.3.4 生长指标测定 株高：用直尺测量茎基部到生长点之间的距离。茎粗：采用电子游标卡尺进行测量，测量的位置统一在茎基部。

1.3.5 盐害指数与植株耐盐性 根据盐害指数，对照表3的分级标准确定耐盐性。

表3 盐害指数对应的耐盐性

1.3.6 叶绿素含量测定 参考高俊凤等[15]的方法。先按照体积比配制80%丙酮的提取液待用。24 h后可直接将试管中的绿色液体进行测量，即使用比色皿在分光光度计上测量663 nm以及645 nm波长下的吸光度值，根据公式计算叶绿素a(content of chlorophylla，Ca)和叶绿素b的含量(content of chlorophyllb，Cb)。

Ca=(12.71A663-2.59A645)V/(1 000 W)

Cb=(22.88A645-4.67A663)V/(1 000 W)

C总=Ca+Cb

式中，叶绿素含量的单位为mg·g-1；A663和A645分别为663 nm和645 nm波长下的吸光度值；V为提取溶剂体积，即10 mL；W为所取黄瓜叶片质量。

1.3.7 脯氨酸含量测定 采用酸性茚三酮法，具体步骤参考李合生[16]的方法。

1.3.8 抗氧化酶活性测定 参照André等[17]的方法并稍加改进。准确称取0.1 g黄瓜叶片，放入预冷研钵中，加入0.04 g聚乙烯毗咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)，用1 mL预冷的提取缓冲液(K2HPO4-KH2PO4，pH值7.0，0.1 mmol·L-1EDTA，5 mmol·L-1巯基乙醇)充分研磨均匀，经两步离心(4 500×g，4℃，10 min和16 000×g，4℃，15 min)，上清液即为酶粗提液。SOD和CAT活性的测定参考高俊凤等[15]的方法；POD活性的测定采用愈创木酚显色法[16]。

1.3.9 丙二醛(MDA)含量的测定 用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，参考李合生[16]的方法。

1.4 数据分析

对测得的黄瓜各项生理生化指标数据进行聚类分析，采用Microsoft Excel 2007制表、作图，用软件SPSS 22.0进行显著性分析以及主成分分析。主成分分析计算参考王吉祥等[18]的方法。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫黄瓜适宜浓度的筛选

由表4可知，不同NaCl浓度处理白黄瓜和MC2065，幼苗的盐害指数随着盐浓度的增大而升高。盐浓度小于100 mmol·L-1时盐害指数均为0。盐浓度大于等于100 mmol·L-1时盐害指数显著提高，盐浓度大于150 mmol·L-1时盐害指数达到最大值，为100%。当盐浓度为100 mmol·L-1时白黄瓜盐害指数为35.94%，出现较明显的盐害胁迫，而MC2065盐害指数为4.69%，没有明显的盐害表现；当盐浓度提高到150 mmol·L-1时两者均表现出较明显的盐害胁迫，MC2065出现半数以下的叶片枯萎，而白黄瓜出现半数以上的叶片枯萎，萎蔫程度较明显，呈现半致死状态(图2)，因此将100和150 mmol·L-1作为黄瓜耐盐鉴定的适宜盐浓度。

图2 白黄瓜和MC2065在不同盐浓度处理后的性状表现

表4 不同NaCl胁迫对黄瓜盐害指数影响

2.2 NaCl胁迫对各种质黄瓜幼苗株高、茎粗的影响

在盐胁迫下，21个种质的黄瓜幼苗株高、茎粗均受到不同程度的抑制，并且随着盐浓度的增高抑制程度越高。与CK相比，DY1、D1503、XB23和DRT345在100和150 mmol·L-1处理下株高均受到显著抑制，抑制程度在28.33%以上。与CK相比，DRTJY-2和寿水1的株高只在150 mmol·L-1处理下受到显著抑制，分别较CK降低60.00%和61.99%(图3-A)。盐浓度处理后不同种质的茎粗呈下降趋势，同CK相比，XY1、寿水1在100 mmol·L-1处理下降幅度最大，分别下降了37.31%和46.47%；20S091-1在150 mmol·L-1处理下降幅度最小，为2.88%(图3-B)。

图3 NaCl胁迫对各种质黄瓜幼苗株高、茎粗的影响

2.3 NaCl胁迫对各种质黄瓜幼苗盐害指数与存活率的影响

由表5可知，21种黄瓜幼苗的盐害程度随盐胁迫浓度的增大而增大，盐害指数也随之增高。100 mmol·L-1处理下，DJ04、DY-1、DRTJY-2、YY9123、SJ11-1、M2XT、寿水1、HLT-921h、X805、DRT345、N26-5-1 一半以上的种质表现出盐害症状。其中DJ04、M2XT、寿水1、N26-5-1的盐害指数为10%，其余种质的盐害指数为5%。而在150 mmol·L-1浓度处理下，所有黄瓜幼苗均表现出盐害症状，其中DY-1、M2XT、20S077-1、DJ04、D1503、HLT-921h、XY1的盐害程度较高，其盐害指数达到45%以上，划分为盐敏感类群；而F-6-3-1、DRTJY-2、莱西、AZ-1、寿水1、DRT345的盐害程度较低，其盐害指数在30%以下，划分为耐盐类群。在0、100、150 mmol·L-1三组NaCl处理下，只有150 mmol·L-1处理黄瓜幼苗出现死亡现象，所以利用150 mmol·L-1NaCl浓度的存活率，比较各黄瓜种质的耐盐性。其中莱西、寿水1、ZQ3、N26-5-1这4个黄瓜幼苗种质的存活率均为100%，而DY-1、D1503、XY1、DRT345这4个黄瓜种质的存活率较低，分别为18.18%、25.00%、27.27%、25.00%，DJ04和F-6-3-1这2个种质的黄瓜幼苗全部死亡。

表5 NaCl胁迫对各种质黄瓜幼苗盐害指数与存活率的影响

2.4 NaCl胁迫对各种质黄瓜幼苗叶绿素含量的影响

由图4可知，黄瓜幼苗(除XB23、ZQ3、N26-5-1在150 mmol·L-1处理下)叶绿素含量在盐胁迫下均下降，并且随着盐浓度的增加降幅升高。与CK相比，XY1、F-6-3-1在150 mmol·L-1处理下叶绿素含量下降最为明显，分别下降89.43%、86.12%，而XB23、20S091-1、N26-5-1这3个种质的叶绿素含量下降较少，分别下降7.70%、2.48%、4.98%。

图4 NaCl胁迫对各种质黄瓜幼苗叶绿素含量的影响

2.5 NaCl胁迫对各种质黄瓜幼苗脯氨酸、抗氧化酶活性的影响

由图5可知，与CK相比，随着NaCl浓度增加，黄瓜幼苗的脯氨酸含量、SOD活性、POD活性及CAT活性整体呈上升趋势，在150 mmol·L-1时差异最明显。

与CK相比，在150 mmol·L-1处理下，DJ04、D1503、翠玉、寿水1、HLT-921h的脯氨酸增幅较大，分别上升1 208.66%、966.44%、646.54%、679.97%、776.26%(图5-A)；SOD活性在SJ11-1、寿水1、HLT-921h、F-6-3-1中上升幅度较大，分别上升91.48%、94.93%、158.57%和118.59%。而DJ04、DY-1呈下降趋势，分别下降4.75%、13.19%(图5-B)；POD活性在DJ04、DRTJY-2、翠玉、莱西、XB23、20S091-1、20S077-1、ZQ3、N26-5-1中随着盐浓度的增加而上升，而DY-1、D1503、YY9123、AZ-1、SJ11-1、M2XT、X805、F-6-3-1的POD活性呈先升高后降低的趋势，XY1、寿水1的POD活性呈先降低后升高的趋势。与CK相比，在150 mmol·L-1处理下，HLT-921h、F-6-3-1的POD活性增幅较大，分别升高158.57%和129.38%(图5-C)；与CK相比，在150 mmol·L-1NaCl胁迫下，D1503、X805的CAT活性增幅较大，分别上升251.09%和116.71%(图5-D)。

图5 NaCl胁迫对各种质黄瓜幼苗脯氨酸、抗氧化酶活性的影响

2.6 NaCl胁迫对6个代表种质MDA含量的影响

由图6可知，在不同浓度的NaCl胁迫下，6个种质的MDA含量变化趋势相同，均随盐胁迫浓度的增大呈上升趋势。

图6 NaCl胁迫对6个代表种质MDA含量的影响

相比于CK，在100 mmol·L-1NaCl胁迫下，莱西、D1503的增幅较为明显，分别上升158.77%、574.55%；HLT-921h、YY9123增幅最小，分别上升2.31%和11.62%。在150 mmol·L-1NaCl胁迫下，D1503的MDA含量增幅较为明显，上升了817.93%；HLT-921h的增幅较小，上升46.22%。

2.7 黄瓜耐盐性聚类分析

根据150 mmol·L-1处理下各黄瓜种质间区分度最大，利用SPSS软件进行聚类分析，将供试的21份黄瓜种质分为3个类群(图7)。第一类群包括ZQ3、N26-5-1、寿水1、DRTJY-2、莱西、翠玉、20S077-1，属于耐盐种质，是由对照种质和存活率共同决定的。第二类群包括DJ04、DY-1、XY1、YY9123、M2XT、D1503、X805，属于中耐盐种质。第三类群包括F6-3-1、SJ11-1、XB23、20S091-1、HLT-921h、AZ-1、DRT345，属于盐敏感种质。育种意义上，盐敏感种质可通过与耐盐类群相同生态型种质杂交创制耐盐性较好的品种。

图7 黄瓜种质聚类分群树状图

2.8 黄瓜苗期耐盐性主成分分析与综合评价

从黄瓜幼苗生长量中选取株高、茎粗、叶绿素、盐害指数、脯氨酸、SOD活性、POD活性、CAT活性、存活率9个指标，依据这9个指标进行主成分分析(表6)。结果表明，前4个主成分的特征值大于1，其方差贡献率依次为31.66%、19.53%、15.42%、11.94%，累计方差贡献率已达到78.55%，说明前4个主成分可以反映出9项耐盐指标的大部分信息，因此提取前4个主成分对黄瓜耐盐性进行综合评价分析。

表6 黄瓜幼苗各成分的特征值及贡献率

通过主成分模型计算黄瓜各种质的综合得分，按得分排序得到表7。从排序结果可以看出，采用黄瓜幼苗9项指标主成分分析得出的综合得分趋势与黄瓜幼苗存活率高低趋势基本一致，如N26-5-1和ZQ3黄瓜的存活率最高，其综合得分也最高；DY1的存活率较低，其综合得分亦较低。说明通过存活率筛选得出的结果与主成分分析法所得结果基本相符。

表7 不同黄瓜种质主成分综合得分

3 讨论

黄瓜为设施栽培的主要蔬菜之一，选择耐盐黄瓜品种，是非常重要的技术手段，选择适宜的盐成分及浓度是评价耐盐种质的基础。有大量文献[19-20]均以NaCl作为盐胁迫来研究黄瓜的耐盐性。研究发现，环境中的Cl-和Na+含量升高导致的渗透胁迫造成植物受到伤害，细胞质中Cl-和Na+过量积累会产生离子毒害[21]。因此本研究采用NaCl胁迫处理黄瓜幼苗，测定相关指标筛选耐盐种质资源，不仅能更真实地还原沿海地区的盐渍地环境，还可以更准确地反映黄瓜耐盐性。本研究筛选出的100、150 mmol·L-1NaCl胁迫浓度与曹齐卫等[22]、门立志等[23]研究结果相似，其中100 mmol·L-1NaCl可以作为筛选少量黄瓜材料的筛选鉴定浓度，而在150 mmol·L-1NaCl胁迫下盐害指数达到50%以上，可用于高耐盐种质的筛选。

本试验采用4项形态指标、5项生理生化指标筛选鉴定21份黄瓜材料，其中株高、茎粗在盐胁迫的条件下均受到抑制，并且其抑制程度随着盐胁迫浓度的提高而升高。本试验中，所有黄瓜材料的叶片盐害等级随着盐浓度的增大呈上升趋势，说明浓度越高的盐胁迫对植株造成的伤害越大，这与李卫欣等[24]在南瓜上的研究结果一致；本研究结果表明，在盐胁迫条件下，黄瓜材料叶片中的叶绿素含量均下降，并且随着盐浓度的增加黄瓜幼苗的叶绿素降幅增大，是由于Na+大量积累,抑制了植株对K+、Mg2+的吸收，加剧了光抑制程度[25]，这与乌凤章[26]在柑橘方面的研究结果一致。在较低浓度的盐胁迫下，植物的叶绿素含量随着盐浓度的升高呈上升趋势[27]，这是由于叶绿素的合成需要某些脯氨酸的参与,在较低浓度盐胁迫下，细胞大量积累脯氨酸，从而有利于叶绿素的合成[28]，该现象与本研究中20S077-1、20S091-1的叶绿素变化趋势一致；前人研究表明，在盐胁迫下植物体内会积累大量的脯氨酸等渗透调节物质[29]，从而调节细胞质内的渗透，防止细胞的过度失水导致细胞死亡，并且脯氨酸还能稳定生物大分子的结构，调节细胞的pH值，消除毒害[30]。刘雪超等[31]研究发现，适当浓度的AgNO3可有效调节植物的渗透压，降低过氧化程度；同时在盐胁迫下，植物体内还会产生大量的ROS，ROS水平超出防御机制所及范围，导致蛋白质氧化、酶失活。植物在逆境胁迫下会通过积累渗透调节物质和增加保护酶活性来抵抗逆境，因此耐盐性与脯氨酸含量、保护酶活性的增长量呈正相关[32]，这与本试验结果，即随着NaCl浓度增加，黄瓜幼苗的脯氨酸含量、SOD活性、POD活性及CAT活性整体呈上升趋势一致；在干旱和盐胁迫下，甜菜叶片细胞会发生脂质过氧化，使细胞中积累大量的MDA[33]，因此MDA在植物体内积累量越小，代表其抗性越强。

通过各项单一指标结果发现，各黄瓜种质的耐盐性评价差异性较大，仅用一项或者两项指标无法准确筛选出黄瓜材料的耐盐性，例如通过叶绿素指标表明DRT345的耐盐性较强，这与研究结果一致。而通过株高指标表明DRT345为盐敏感材料。因此本研究采用聚类分析与主成分分析综合鉴定评价黄瓜材料的耐盐性，对比结果发现，两项综合指标筛选出的耐盐性材料基本一致，但DRTJY-2、XB23、20S091-1、翠玉的聚类结果与主成分分析结果存在较大的差异，这可能是两种方法的计算方法和分类标准不同造成的。其中筛选出的耐盐材料N26-5-1来源于中农26号，此种质在北京、河北、辽宁日光温室栽培中表现出较强的耐盐性[34]，说明本试验的筛选方法较科学准确。门立志等[23]研究发现，在各耐盐性指标中，地下部干重量、壮苗指数以及根冠比权重较大，可作为重要的黄瓜耐盐筛选指标。但本试验未对地上部与地下部干鲜重进行称量，而发现存活率可作为一项重要指标筛选黄瓜种质的耐盐性。这与前人的研究方法具有差异，在今后的研究中需要进一步系统性地探索更加科学可靠的耐盐筛选指标。

4 结论

本研究通过对黄瓜材料白黄瓜、MC2065进行5个NaCl盐浓度处理后的盐害指数分析发现，100、150 mmol·L-1NaCl可作为黄瓜苗期耐盐性筛选的适宜浓度。利用该浓度对21份黄瓜种质进行处理，测定株高、茎粗等形态指标，叶绿素、脯氨酸、保护酶等生理生化指标，并用聚类分析和主成分分析进行综合评价。结果表明，莱西、寿水1、ZQ3、N26-5-1的存活率较高，表现出较强的耐盐性，并且综合分析得到，存活率与聚类分析和主成分分析得出的结果基本一致。各项指标主成分分析和聚类分析表明，将所有种质归并为耐盐、中耐盐和盐敏感3类，耐盐材料、中耐盐材料、盐敏感材料各7个，其中耐盐种质的排序为N26-5-1>ZQ3>20S077-1>寿水1>莱西>DRTJY-2>翠玉。