丁香-鱼腥草-普鲁兰多糖复合涂膜对沙糖橘采后诱导抗性保鲜研究

黄娇丽 邓雅妮 易有金 朱树清 邓后勤 朱利红

(1湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410000；2百色学院农业与食品工程学院，广西 百色 533000；3汝城县繁华食品有限公司，湖南 郴州 424100；4汝城县鑫利食品有限公司，湖南 郴州 424100)

柑橘(CitrusreticulataBlanco)为芸香科柑橘亚科柑橘属植物，产量居全国第二。因其分布广、产量大、营养价值高，在我国农业经济中占重要地位，且种植面积每年以4%的速度增长[1]。柑橘在贮运过程中易受侵染性病害影响，从而导致严重的经济损失[2]。目前柑橘采后保鲜仍以化学防治保鲜为主[3]，常用的化学防治药剂主要有抑霉唑、双胍盐和咪鲜胺等，而长期大量使用化学药剂会造成环境污染，破坏生态平衡，提高病原菌耐药性，导致保鲜效果降低[4]。因此研发新型高效、绿色安全的保鲜剂以替代化学防治药剂已成为柑橘采后保鲜的研究热点[5]。

生物防治主要是利用植物源提取物、生物保鲜剂(微生物代谢产物和拮抗菌)等对果实进行保鲜处理[6]。其中，植物源提取物保鲜剂以其显著的效果和环保低毒的特点成为一种具有良好前景的果蔬采后病害防治手段[7-9]。近年来，植物提取物在柑橘类保鲜中的应用越来越多，研究较多的主要有植物精油和中草药提取物保鲜剂。植物精油研究中发现牛至精油、丁香精油和桂皮精油对意大利青霉菌具有较好的抑制效果，经这三种植物精油处理后的柑橘贮藏至第4天仍无腐烂现象[10]。中草药提取物保鲜剂研究中发现桂枝提取物对柑橘青霉菌和绿霉菌具有显著的防治效果[9]。此外，白薇、零陵香、鸦胆子、藏青果、白药子5种中草药乙醇提取物对意大利青霉均有较好的抑制效果，其中白薇醇提取的抑制效果最强[11]。植物源提取物成分复杂，某些中草药提取物之间还存在协同增效作用[12-13]，可通过抑制微生物、诱导果实相关抗性酶活性[11,14]、减少果实生理代谢来降低果实腐烂率[15]，维持果实品质，延长果实贮藏期。因此，研发复合中草药提取物保鲜剂有利于完善植物油提取物贮藏保鲜技术。本研究以沙糖橘为研究对象，考察丁香、肉桂、鱼腥草、广藿香4种抑菌效果较好的中草药对沙糖橘的防腐保鲜效果，以普鲁兰多糖为成膜剂，通过单因素和响应面试验筛选出最佳的丁香-鱼腥草普-鲁兰多糖复合涂膜沙糖橘保鲜剂。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙糖橘，采摘于长沙当地果园；丁香、肉桂、鱼腥草、广藿香，购于湖南省长沙市千金大药房；普鲁兰多糖、壳聚糖(食品级)，郑州市食代添骄化工产品有限公司。

2,6-二氯靛酚钠盐、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾(化学纯)，国药集团化学试剂有限公司；咪鲜胺(剂型：水乳剂，450 g·L-1)，河北省农药化工有限公司。

1.2 仪器与设备

GZ-400-GSII智能人工气候箱，韶关市广智科技设备有限公司；LYT-330手持折光仪，上海淋誉公司；GY-1型果实硬度计，乐清市爱德堡仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 果实涂膜处理 选取无机械损伤、无病虫害、大小均匀的沙糖橘，随机分组，每组30个，设3组平行，各处理组分别在相应的涂膜液中浸泡1 min，自然晾干后置于温度28℃、湿度75%的培养箱中储存，每隔2 d对果实进行指标测定。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 中草药水溶液种类筛选 分别称取粉碎后过40目筛的丁香、肉桂、鱼腥草和广藿香4种中草药材料各30 g，加入蒸馏水，纱布过滤，定容至300 mL，制成0.10 g·mL-1中草药水溶液。将4种中药材水溶液按照1.3.1的方法处理沙糖橘并设置空白对照组CK1，考察贮藏至第6天时不同中草药水溶液对沙糖橘腐烂率的影响。

1.3.2.2 中草药水提液种类筛选 中草药水提液制备参照李滨丞[16]的方法，分别称取粉碎后过40目筛的丁香、肉桂、鱼腥草和广藿香4种中草药材料各30 g，置于烧杯中，加入150 mL蒸馏水，95℃水浴浸提20 min，两层无菌纱布过滤，4 000 r·min-1离心10 min，取上清液定容至300 mL，制成0.10 mg·mL-1的中草药水提液。按照1.3.1的方法处理沙糖橘并设置空白对照组CK1，考察贮藏至第6天时不同中草药水提液对沙糖橘腐烂率的影响。

1.3.2.3 同一中草药不同浓度筛选 中草药粉末溶液：将筛选出的保鲜效果较好的中草药粉末溶液设置质量浓度梯度为0.05、0.10、0.15、0.20 mg·mL-1，按照1.3.1的方法处理沙糖橘并设置空白对照组CK1，考察贮藏至第6天时不同浓度中草药粉末溶液对沙糖橘失重率和腐烂率的影响，筛选出的最适中草药粉末溶液浓度。中草药水提液：将筛选出的保鲜效果较好的中草药水提液设置浓度梯度为0.10、0.20、0.40、0.50 mg·mL-1，按照1.3.1的方法处理沙糖橘并设置空白对照组CK1，考察贮藏至第6天时不同浓度水提液对沙糖橘腐烂率的影响，筛选出最适水提液浓度。

1.3.2.4 成膜剂不同浓度筛选 将筛选出的保鲜效果较好的成膜剂设置质量浓度梯度为0.50%、1.00%、1.50%、2.00%，按照1.3.1的方法处理沙糖橘并设置空白对照组CK1，考察贮藏至第6天时不同浓度成膜剂对沙糖橘失重率和腐烂率的影响，筛选出最适成膜浓度。

1.3.3 响应面优化试验 在单因素试验的基础上，以综合加权指标为响应值，根据响应面Box-Behnken设计原理，以普鲁兰多糖浓度(A)、丁香水提液浓度(B)、鱼腥草粉末溶液浓度(C)3个因素为自变量，以综合加权指标为响应值，进行三因素三水平的响应面优化试验，确定最优组合。综合加权指标参照汤晓雨[17]的试验方法，按以下公式进行加权求和，得到综合加权指标(Y)。

(1)。

1.3.4 复合涂膜保鲜剂对沙糖橘保鲜效果验证试验 根据筛选出的最优方案配制复合涂膜保鲜剂(保鲜剂组)，以阳性对照组(0.225 g·L-1咪鲜胺，咪鲜胺为有效成分450 g·L-1的水乳剂)、CK1(不做任何处理组)、CK2(蒸馏水处理组)为对照，按照1.3.1的方法处理沙糖橘，试验10 d，每2 d测定一次沙糖橘品质相关指标，以评估沙糖橘的保鲜效果。

1.3.5 沙糖橘相关指标测定

1.3.5.1 腐烂率测定方法 采用计数法，按照公式(2)计算果实腐烂率：

(2)。

1.3.5.2 失重率测定方法 采用称重法，按照公式(3)计算果实的失重率：

(3)。

1.3.5.3 生理生化指标测定 参照曹建康等[18]的方法测定。静置法测定呼吸强度，手持折光仪测定可溶性固形物含量，2, 6-二氯酚靛酚滴定法测定抗坏血酸含量，氢氧化钠溶液滴定法测定可滴定酸含量，硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定丙二醛含量，愈创木酚氧化法测定过氧化物酶(peroxidase, POD)活性，邻苯二酚氧化法测定多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性。

1.3.5.4 感官评定 参照张伟清等[19]的评分标准，详见表1。选10名食品专业研究生对贮藏至第10天的沙糖橘进行感官评价。

表1 沙糖橘感官评分标准

1.4 数据处理

运用 Design Expert 8.0.6.1软件进行响应曲面图绘制，Origin 2019软件作图，数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，采用Duncan多重比较进行显著性分析，P<0.05表示组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 中草药水溶液种类筛选 不同中草药水溶液对沙糖橘腐烂率的影响见表2。贮藏至第6天时，4种中草药水溶液组沙糖橘的腐烂率与CK1差异显著，其中鱼腥草水溶液处理的沙糖橘腐烂率最低，为50%，比CK1降低了30个百分点。因此选择鱼腥草水溶液进行不同浓度筛选。

表2 不同中草药水溶液对沙糖橘腐烂率的影响

2.1.2 中草药水提液种类筛选 不同中草药水提液对沙糖橘腐烂率的影响见表3。贮藏至第6天时，4种中草药水提液处理的沙糖橘腐烂率均与CK1差异显著(P<0.05)，其中丁香水提液处理的沙糖橘腐烂率最低，为25%，比CK1降低了55个百分点。可见丁香水提液的保鲜效果较佳。

表3 不同中草药水提液对沙糖橘腐烂率的影响

2.1.3 鱼腥草水溶液浓度筛选 由表4可知，贮藏至第6天时，0.10 mg·mL-1鱼腥草处理的沙糖橘失重率最低，为13.83%，与CK1相比显著降低了12.9个百分点。0.10 mg·mL-1与0.05 mg·mL-1鱼腥草处理的沙糖橘腐烂率均为55%，与CK1相比显著降低了20个百分点。综合沙糖橘失重率和腐烂率的结果，确定0.10 mg·mL-1鱼腥草水溶液为最适浓度。

表4 4种不同质量浓度鱼腥草水溶液对沙糖橘失重率和腐烂率的影响

2.1.4 丁香水提液浓度筛选 由表5可知，贮藏至第6天时，0.20 mg·mL-1丁香水提液处理的沙糖橘腐烂率最低，为40%，与CK1相比显著降低了35个百分点。因此确定0.20 mg·mL-1丁香水提液为最适浓度。

表5 4种不同浓度丁香水提液对沙糖橘腐烂率的影响

2.1.5 普鲁兰多糖浓度筛选 由表6可知，贮藏至第6天时，1.0%普鲁兰多糖处理的沙糖橘失重率和腐烂率均为最低，失重率为15.75%，与CK1相比显著降低了10.98个百分点；腐烂率为55%，与CK1相比显著降低了20个百分点。综合沙糖橘失重率和腐烂率的结果，确定1.0%普鲁兰多糖溶液为最适浓度。

表6 4种不同浓度普鲁兰多糖溶液对沙糖橘失重率和腐烂率的影响

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面优化试验结果分析 根据Box-Behnken中心组合设计原理, 结合单因素试验结果，以普鲁兰多糖浓度(A)、丁香水提液浓度(B)、鱼腥草粉末溶液浓度(C)3个因素为自变量，以综合加权指标为响应值，进行三因素三水平响应面分析试验，结果见表7和表8。

表7 响应面试验因素和水平设计表

表9 加权综合值回归方程方差分析

2.2.2 验证试验 由回归方程得到复合保鲜剂最优组合为丁香水提液浓度0.24 mg·mL-1、普鲁兰多糖浓度1.06%、鱼腥草水溶液浓度0.10 mg·mL-1，该组合下得出最大加权综合理论值7.38。根据实际试验情况，将该最优组合调整为丁香水提液浓度0.20 mg·mL-1、普鲁兰多糖浓度1.50%、鱼腥草水溶液浓度0.10 mg·mL-1，对该试验组进行验证试验，测得沙糖橘在28℃、相对湿度75%条件下贮藏6 d后加权综合指标平均值为7.64，与理论预测值接近，说明该模型拟合性良好，验证了模型的有效性。

2.3 复合涂膜保鲜剂对沙糖橘保鲜效果验证试验结果

2.3.1 复合涂膜保鲜剂对沙糖橘失重率和腐烂率的影响 如图1-A所示，沙糖橘失重率随贮藏时间的延长而上升，保鲜剂组和阳性对照组在整个贮藏期间均处于最低水平。贮藏至10 d时，CK1、CK2、阳性对照组、保鲜剂组的失重率分别为39.13%、37.28%、29.25%、28.24%，保鲜剂组与CK1、CK2和阳性对照组相比，分别降低了27.83、24.24、3.45个百分点，与CK1、CK2有显著差异，与阳性对照组相比无显著差异。

注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

如图1-B所示，各处理组从第4天开始出现腐烂，随着贮藏时间的延长，腐烂率递增，至第10天时，CK2的腐烂率高达55%，其次是CK1，为40%，阳性对照组和保鲜剂组腐烂率较低，分别为30%和25%，均与CK2差异显著。

2.3.2 复合涂膜保鲜剂对沙糖橘感官评分的影响 由图2可知，沙糖橘贮藏10 d后，保鲜剂组沙糖橘外观和结构得分均显著高于CK1和CK2，与阳性对照组无显著差异，而气味得分显著低于CK1、CK2和阳性对照组，口感得分与CK1和CK2无显著差异，而显著低于阳性对照组。由图3可知，保鲜剂组可有效降低沙糖橘的腐烂率，其外观和结构结果与感官得分结果一致。

图2 不同处理对沙糖橘贮藏至第10天时感官得分的影响

图3 不同处理沙糖橘贮藏至第10天的外观

2.3.3 复合涂膜保鲜剂对沙糖橘营养品质的影响 如图4-A所示，保鲜剂组和阳性对照组与CK1和CK2相比，其可溶性固形物含量降低较缓慢，当贮藏至第10天时，保鲜剂组的可溶性固形物含量为10.72%，其次是阳性对照组、CK1和CK2。保鲜剂组和其他处理组存在显著差异，说明保鲜剂组可有效抑制沙糖橘可溶性固形物的消耗。

图4 不同处理对沙糖橘可溶性固形物含量(A)、VC(B)和可滴定酸含量(C)影响

由图4-B可知，在贮藏过程中，各处理组果实的VC含量均呈现下降的趋势，贮藏前2 d，各组果实VC含量差异较小，贮藏时间越长，各组VC含量差异逐渐增大，贮藏至第10天，保鲜剂组与阳性对照组VC含量差异不显著，而与CK1差异显著，保鲜剂组的VC含量为11.75 mg·100 g-1，与CK1、CK2相比，分别增加了57.72%和23.29%，与阳性对照组相比降低了13.79%。

由图4-C可知，随着贮藏时间的延长，各处理组的可滴定酸含量呈下降趋势，当贮藏至第10天时，保鲜剂组的可滴定酸含量在4个处理组中最高，为0.50%，阳性对照组为0.43%，与CK1和CK2相比，保鲜剂组可滴定酸含量分别提高了0.15、0.16个百分点。保鲜剂组可显著减缓可滴定酸含量的降低。

2.3.4 复合涂膜保鲜剂对沙糖橘衰老及防御相关酶的影响 如图5-A所示，4组沙糖橘的呼吸强度均随贮藏时间的延长而降低。保鲜剂组和阳性对照组在整个贮藏期间呼吸强度均低于CK1和CK2，且贮藏至第6天时，保鲜剂组与CK1和CK2差异显著。贮藏至第10天时，保鲜剂组和阳性对照组无显著差异，保鲜剂组的呼吸强度为10.47 mg·kg-1·h-1，与CK1、CK2和阳性对照组相比，分别降低了42.97%、36.62%和16.11%。

图5 不同处理对沙糖橘呼吸强度(A)、丙二醛含量(B)、POD(C)和PPO(D)的影响

如图5-B所示，在整个贮藏期间，所有处理组的丙二醛含量逐渐上升，保鲜剂组和阳性对照组沙糖橘的丙二醛含量在整个贮藏期间均处于较低水平，且从贮藏至第6天开始，与CK1和CK2差异显著，保鲜剂组和阳性对照组差异不显著。说明保鲜剂组和阳性对照组保鲜效果相似。

如图5-C所示，在贮藏期间，POD活性先上升后下降。在贮藏第2天，出现第一个峰，各处理组之间没有显著差异。贮藏至第6天出现最大峰值，随后各处理组的POD活性开始下降，CK1和CK2下降最明显，而保鲜剂组和阳性对照组下降相对缓慢，第10天的 POD活性均比第0天高，且保鲜剂组和阳性对照组间无显著差异，与CK1和CK2差异显著。

如图5-D所示，在贮藏过程中，沙糖橘果实的PPO活性呈现先上升后下降的趋势，贮藏至第6天时出现最高峰。保鲜剂组和阳性对照组的PPO活性始终高于CK1和CK2，且除第8天外，显著高于CK1和CK2。

3 讨论

本研究发现鱼腥草水溶液对沙糖橘腐烂率抑制效果较好，可能是由于鱼腥草主要含有挥发油、黄酮类、生物碱、有机酸和多糖等[20]，而鱼腥草多糖是鱼腥草主要水溶性成分[21]，具有抗氧化、抗病毒、消炎抑菌等生物活性功能[22]。丁香水提液对沙糖橘保鲜效果较好，可能是由于丁香水提液中主要是丁香酚和黄酮类物质，其中丁香酚是丁香的主要有效成分[23]，对植物病原真菌具有较强的抑菌活性[24]。

水分流失会导致果实枯萎、干枯、褐变，改变果实的质地、味道，并加速衰老[25]。失重率是反映沙糖橘贮藏过程中水分和干物质减少的重要指标。本试验发现，从贮藏第4天开始，丁香-鱼腥草-普鲁兰多糖复合保鲜剂处理组的失重率显著低于CK1和CK2，可能是由于表面涂膜有助于覆盖果皮表面的微裂纹，形成一层保护膜，从而减少果实水分的蒸发[26]。沙糖橘由于果皮较薄，在贮藏过程中容易受到机械损伤，易受微生物侵染而腐烂。本研究发现保鲜剂组在贮藏至第10天时，其腐烂率在4个处理组中最低，为25%，可能是由于丁香鱼腥草水溶液和提取液中含有丁香酚、丁香精油、生物碱、有机酸及多糖等生物活性成分，具有抑菌、抗氧化等功效[27]，可抵抗外界病菌的侵染，从而达到与阳性对照组相近的效果，这与Mahdi等[28]和卢山等[29]的研究一致。

在贮藏过程中，各处理组沙糖橘的可溶性固形物、VC含量和可滴定酸含量逐渐下降，贮藏至第10天，保鲜剂组处理的可溶性固形物和可滴定酸含量显著高于CK1和CK2，VC含量与阳性对照组无显著差异。可能是由于沙糖橘属于非呼吸跃变型果实，在贮藏过程中直接进入衰老，可溶性糖等在代谢过程中被逐渐消耗而降低。VC是沙糖橘的重要营养物质之一，是一种水溶性抗氧化剂，可清除自由基，从而延缓果实的衰老[30]。Adriana等[31]研究发现沙糖橘贮藏16周之后，涂膜处理和商品涂蜡处理均对沙糖橘中VC含量无显著影响，可能由于涂膜后在水果表面形成气体屏障，形成相对的低O2和高CO2的环境，从而降低了VC的氧化。保鲜剂处理有效延缓了可滴定酸含量的降低，可能是由于该处理使沙糖橘的新陈代谢发生改变或者延缓了呼吸过程中有机酸的消耗，该结果与Baswal等[32]的研究结果相似。

各处理组沙糖橘的呼吸强度随贮藏时间的延长而降低，在整个贮藏期间，保鲜剂组果实的呼吸强度始终低于CK1和CK2。原因可能是呼吸作用与CO2/O2浓度和细胞内呼吸酶的活性有关[33]，而保鲜剂的涂膜处理使果实表面环境形成较低的O2浓度和较高的CO2浓度，从而降低了呼吸速率。在本研究中，保鲜剂处理显著提高了沙糖橘果实的POD活性，其PPO活性始终高于CK1和CK2。该结果与橙皮素处理可提高沙糖橘果皮PPO和POD活性的结果一致[34]。POD被认为是诱导植物和果实抗病性的关键酶之一，而PPO参与木质素的合成，促进细胞壁的木质化[35]，从而提高果实对病原菌的抗性。丙二醛是果蔬衰老过程中膜脂过氧化作用的主要产物之一，果蔬衰老时丙二醛含量增加，因此抑制丙二醛含量的积累可以延缓果蔬的衰老[36]。在整个贮藏期间，各处理组丙二醛含量随时间增加而上升，从贮藏第6天开始，保鲜剂组丙二醛含量显著低于CK1和CK2，而与阳性对照组差异不显著，表明保鲜剂处理组有效抑制了沙糖橘丙二醛含量的积累。可见，保鲜剂处理组可有效延缓沙糖橘果实衰老，抑制其腐烂。

4 结论

本研究探讨了丁香、肉桂、鱼腥草、广藿香4种中草药的粉末溶液和水提液对沙糖橘的防腐保鲜效果，筛选出最佳的粉末溶液和水提液分别为0.10 mg·mL-1鱼腥草和0.20 mg·mL-1丁香水提液，并以商业化学保鲜剂咪鲜胺处理组为阳性对照组，考察丁香-鱼腥草-普鲁兰多糖复合涂膜对沙糖橘贮藏品质的影响。结果表明，最优复合保鲜剂组合为0.20 mg·mL-1丁香水提液、1.50%普鲁兰多糖和0.10 mg·mL-1鱼腥草粉末溶液。保鲜剂组对沙糖橘保鲜效果与阳性对照组咪鲜胺接近，与CK1和CK2相比，保鲜剂处理组对沙糖橘贮藏期间的品质有一定的改善作用，可以降低沙糖橘的失重率和腐烂率，延缓沙糖橘可溶性固形物、VC含量和可滴定酸含量的降低，并抑制沙糖橘的呼吸强度，减少丙二醛含量的积累，保持较高的PPO和POD活性。本研究结果体现了中草药提取物复合保鲜的优势，但中草药成分复杂，其中的协同效应机理还有待进一步研究。