刺山柑总生物碱抑制系统性硬皮病小鼠皮肤纤维化的作用机制探讨

康小龙，赵宇涵，何承辉

1 新疆医科大学附属中医医院药研室，乌鲁木齐830000；2 新疆中药炮制研究重点实验室；3 新疆维吾尔自治区药物研究所药剂室

系统性硬皮病（SSc）的主要特征为纤维化，是一种复杂的、动态的病理生理过程，可导致组织损伤［1］，其临床症状首先出现雷诺现象，然后是手指和手背肿胀，皮肤变厚，急性肾危象，肺纤维化和肺动脉高压等［2］。SSc 多发于女性，女性患病为男性的5倍，其病死率极高，平均五年生存率约为85%，肺部受累（间质性肺病和肺动脉高压）是引起死亡的最主要原因［3］。SSc 的发病机制尚不清楚，针对SSc 尚未有一种特效诊疗手段，研究其发病机制及有效治疗药物已成为医药领域的一个重要目标。研究表明，SSc 患者受损皮肤和从皮肤样本中分离培养的成纤维细胞中都检测到Notch 信号的激活，提示Notch 信号通路与SSc 有着密切的相关性［4］。本实验室从新疆传统维吾尔药刺山柑果实中提取了有效成分刺山柑总生物碱，前期研究表明其可使SSc 模型小鼠真皮鳞状上皮变薄，皮脂腺增多，炎性细胞浸润减轻，能有效抑制皮肤胶原沉积，可能对SSc 皮肤纤维化有一定改善作用［5-6］。基于前期实验，本实验观察了刺山柑总生物碱对SSc Notch 通路重要节点蛋白Notch2、Jagged1、MAML1、Hes1 蛋白的调节作用，评价其对SSc Notch 通路的影响，探讨刺山柑总生物碱抑制SSc皮肤纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无病原体雌性BALB/c小鼠60只，6 周龄，合格证号为SCXK（京）2016-0006，购自北京维通利华实验动物公司。

1.2 药物、试剂及仪器 博莱霉素（生产批号17001711）购自海正辉瑞制药有限公司，青霉胺片（生产批号052160901）购自上海上药信谊药厂。兔抗小鼠Notch2、Jagged1、MAML1、Hes1 抗体及山羊抗兔IgG-HRP 购自美国Cell Signaling 公司，SABC 免疫组化试剂盒、Lowry 法蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。Multifuge X1R型低温离心机购自美国Thermo Fisher 公司，RM2245 型组织切片机、DFC360FX 型显微镜购自德国Leica 公司，Mini-protean Tetra System 型Western blotting 设 备 购自美国Biorad公司。

1.3 刺山柑总生物碱的提取 刺山柑干果打粉过筛，95%乙醇（10倍量）水浴（80 ℃）回流提取2次，每次0.5 h，合并过滤，减压浓缩至药材为药液质量的2倍。紫外分光光度法定量总生物碱占提取物的32%（w/w），高效液相色谱法测得盐酸水苏碱在提取物中含量为2.2%（w/w）。

1.4 实验动物分组、SSc 模型制备、刺山柑总生物碱外敷方法及标本取材 将60只小鼠随机分为4组各15只。刺山柑总生物碱给药组、模型组和阳性对照组均制备SSc模型［7-8］，小鼠背部被毛剃去，皮下注射博莱霉素造模（30 μg/d，30 d）。空白对照组不制备SSc 模型，仅背部皮下注射生理盐水。造模结束后，按刺山总生物碱乳膏临床给药剂量换算小鼠给药剂量为450 mg/kg，将药物外敷小鼠背部注射部位，阳性对照组灌胃给予青霉胺片（125 mg/kg），模型组、空白对照组背部注射部位外敷不含药基质，1次/天，共60 d。末次给药后，各组小鼠均注射过量麻醉剂10%水合氯醛处死，取背部注射部位皮肤约0.2 g，一部分冻存于-80 ℃，用于Western blotting 实验，另一部分置于10%甲醛中，用于免疫组化实验。

1.5 小鼠背部注射部位皮肤组织Notch2、Jagged1、MAML1 蛋白检测 采用Western blotting 法。取存于-80 ℃的皮肤组织标本，加入预冷的RIPA裂解液制成10%组织匀浆，冰上裂解30 min，以12 000 r/min速度离心20 min，取上清液，用Lowry 法测定蛋白浓度，等量的蛋白样品用十二烷基磺酸聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到PVDF 膜上，Notch2、Jagged1、MAML1 一抗4 ℃下孵育12 h，用HRP 标记的抗小鼠二抗孵育1 h，ECL 发光后显影，使用ImageJ 软件测量条带的灰度值。以待测蛋白与内参β-actin 条带灰度值的比值作相对蛋白表达量分析。

1.6 小鼠背部注射部位皮肤组织Hes1 蛋白检测 取置于10%甲醛中的皮肤组织标本，脱水，石蜡包埋，切片，行免疫组化染色：兔抗小鼠Hes1一抗在4 ℃孵育12 h，山羊抗兔IgG-HRP 二抗室温孵育1 h，DAB 染色，水洗后苏木精复染。显微镜摄片，Image-Pro Plus 6.0 软件对图片进行Hes1 的相对表达量分析，平均光密度（MOD）=积分光密度（IOD）/组织面积（area），以平均光密度值作为Hes1 相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组皮肤组织Notch2、Jagged1、MAML1、Hes1蛋白相对表达量比较见表1。

表1 各组皮肤组织Notch2、Jagged1、MAML1、Hes1蛋白相对表达量比较（±s）

表1 各组皮肤组织Notch2、Jagged1、MAML1、Hes1蛋白相对表达量比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。

组别刺山柑总生物碱组模型组阳性对照组空白对照组n 15 15 15 15 Notch2蛋白0.184±0.007△0.236±0.010*0.181±0.008△0.179±0.007 Jagged1蛋白0.645±0.024△0.953±0.035*0.672±0.025△0.654±0.024 MAML1蛋白0.926±0.034△0.676±0.025*0.708±0.060 0.474±0.185 Hes1蛋白0.175±0.049△0.343±0.124*0.143±0.021△0.105±0.012

3 讨论

SSc 是一种慢性纤维化结缔组织疾病，会影响皮肤和各种内脏器官，包括肺、胃肠道和心脏，预后较差。SSc 早期的组织病理学特征是血管周围炎性浸润和毛细血管密度降低，而晚期的特征是细胞外基质过度积累［9-10］，由此产生的纤维化破坏了受影响组织的生理结构并干扰了正常的器官功能，组织纤维化是SSc 患者死亡的主要原因［11］。在弥漫性皮肤SSc 患者中，总体10 年生存率为60%～70%［11］。SSc的发病原因尚不能完全解释清楚，但是可能和遗传因素有关，遗传基因差异性可以解释SSc 的易感性和临床异质性。也有研究表明，SSc 患病是接触了某些化学品与职业病的原因（如氯乙烯和有机溶剂）［12-13］。SSC 发病机制尚不完全清楚，并且目前还没有一种特别有效的治疗方法或者特效药物，所以研究SSc 的发病机制和有效治疗药物成为了一个热点［14-15］。

刺山柑又名老鼠瓜、野西瓜、槌果藤，为白花菜科山柑属植物，系维吾尔医习用药材之一，多分布在新疆南北坡地，喜生于沙漠戈壁和低山坡石质沙土地带，我国新疆、西藏等地均有分布。刺山柑性味辛苦温，具有祛风散寒、除湿、消肿止痛、扩张血管的功效。研究表明，刺山柑乙醇提取物可抑制SSc 患者成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原的合成［16］；刺山柑鲜果75%乙醇调制的糊膏以及刺山柑流浸膏均能显著抑制硬皮病模型小鼠的真皮增厚、胶原沉积［17］；刺山柑乙酸乙酯和乙醇提取物能减小硬皮病小鼠真皮厚度，抑制Ⅰ型胶原及转化生长因子-β1表达［18］。本课题组从刺山柑中提取了有效部位刺山柑总生物碱，其可使博莱霉素诱导的SSc 小鼠真皮鳞状上皮变薄，胶原纤维明显减少，排列疏松、均质化，皮脂腺增多，炎性细胞浸润明显减少；可明显降低小鼠真皮厚度，降低小鼠皮肤羟脯氨酸，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量和胶原沉积，降低Ⅰ型胶原α 亚单位及α-平滑肌肌动蛋白表达，抑制SSc 纤维化形成过程中成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，减少胶原表达，减少细胞外基质合成，改善SSc组织纤维化［19-21］。

Notch 通路是一种进化上高度保守的信号通路，有5 种 不 同 的Notch 配 体Jagged1、Jagged2 和Delta-like 1、3、4和4种不同的Notch受体（Notch1-4），Notch受体及配体都是跨膜蛋白，通过细胞间的相互作用启动信号级联，Notch 受体与其配体之一结合，会诱导Notch 构象变化，导致S2 位点暴露，在ADAM17 金属蛋白酶作用下引发Notch 在细胞外分裂，释放出Notch 的胞内段（NICD），NICD 转位到细胞核，NICD 与核中RBP-Jκ 的结合通过组蛋白乙酰基转移酶的募集和共激活物MAML1 相互作用，通过置换与结合的共阻遏物复合物来激活转录，启动目的基因的转录，这些基因主要属于Hes 和Hey 家族，上述Notch 传导途径被称为经典的Notch通路［22-24］。

最近一些文献表明，Notch信号的过度表达可能在多种疾病中产生纤维化效应，包括硬皮病、特发性肺纤维化、肾纤维化和心脏纤维化［25-26］。异常的Notch 信号与SSc 有关［27-28］，Notch 配体Jagged1 在SSc皮肤过度表达，诱导SSc 成纤维细胞内NICD 的积累，导致靶基因转录增加［27］。在SSc 患者体内也证实了存在Notch2 上调，并且Notch2 的活化促进了纤维化的进展［29］。重组Jagged1 在健康皮肤成纤维细胞中诱导出类似SSc 的表型，它刺激静息期成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，促进胶原蛋白的释放［27］。用DAPT（一种阻止NICD 释放的分泌酶抑制剂）治疗小鼠，可以减少皮肤和肺部的胶原含量和自身抗体的产生，从而阻止不同小鼠模型中SSc 的发展［30-31］；Notch 信号在SSc 患者和不同的实验性纤维化模型中被激活，并伴随着NICD 的积累和目标基因Hes1转录的增加，用Notch siRNA治疗SSc小鼠可以防止皮肤增厚和纤维化［31］。与上述研究相同，本实验也证实Notch 通路相关蛋白Notch2、Jagged1、MAML1 和Hes1 在模型组小鼠皮肤过表达，提示模型组小鼠存在Notch 通路的过度激活，而刺山柑总生物碱可下调Notch2、Jagged1 和Hes1 蛋白的表达，提示SSc 小鼠受损皮肤Notch 通路中过表达的Notch2、Jagged1 和Hes1 可被刺山柑总生物碱抑制，其对SSc Notch 通路的过度激活有一定调控作用。而刺山柑总生物碱组MAML1 蛋白表达却显示升高，具体原因还不清楚，还需进一步的实验加以验证。

总之，刺山柑总生物碱可调控SSc 小鼠受损皮肤Notch 通路，具体作用机制为抑制Notch2、Jagged1、Hes1蛋白表达。