叶酸受体α监测循环肿瘤细胞诊断非小细胞肺癌的效能研究

刘天成 马志红 田萍 刘矿 刘红松 臧金

肺癌是我国目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，其5年生存率不到15%[1]。有报道认为，肺癌的早期诊断、及时治疗可使患者5年生存率提高到85%[2]。因此，探寻新的肺癌早期诊断方法或标志物对提高肺癌的治疗效果及疾病转归具有重要的临床意义。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是存在于外周血中各类肿瘤细胞的统称，系自发或诊疗操作从实体瘤病灶脱落，进入外周血循环的肿瘤细胞或细胞簇。通过对CTCs的检测可动态监测原发肿瘤灶癌细胞入血情况，能够提高患者的早期诊断率，并对患者的治疗效果及预后作出客观评价。早期的研究表明，采用检测上皮细胞黏附分子阳性CTCs（EpCAM+CTCs）的方法诊断非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），晚期 NSCLC 患者的阳性率仅为 50%[3]，究其原因，CTCs在发生上皮间质转化时会发生上皮细胞表型丢失，从而造成EpCAM+CTCs的漏检或假阴性。叶酸受体 α（folate receptor alpha，FRα）是一种与叶酸结合的糖基化磷脂酰肌醇锚定糖蛋白，在多种肿瘤的细胞膜上过度表达，而在大多数正常组织中表达水平极低[4-7]。因此，本研究以FRα为靶点，检测NSCLC患者外周血中叶酸受体α阳性循环肿瘤细胞（FRα+CTCs）水平，探讨其诊断NSCLC的效能。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016年1月至2020年12月湖州市中心医院收治的149例 NSCLC患者，其中男83例，女 66 例，年龄 45～74（63.2±8.3）岁；鳞癌 63 例，腺癌86例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期56例，Ⅲ～Ⅳ期93例。所有患者均确诊为原发NSCLC，无其他上皮性肿瘤或传染病病史，临床资料完整，均未接受放化疗。选择本院同期肺部良性疾病患者60例为良性对照组，男35例，女 25 例，年龄 46～80（62.8±9.3）岁；其中肺结核 8 例，肺部炎性假瘤12例，支气管扩张症15例，慢性阻塞性肺疾病25例。选择本院同期健康体检者60名作为阴性对照组，男 37名，女 23名，年龄 40～71（60.8±9.6）岁。3组对象性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2 方法 取3组对象清晨空腹静脉血3 ml，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，30 min内进行检测，采用配体靶向聚合酶链式反应（ligand target PCR，LT-PCR）方法检测FRα+CTCs水平。检测步骤按照格诺思博生物科技有限公司提供的Cytolorare循环肺癌细胞试剂盒说明书操作，以FU/3 ml为FRα+CTCs单位。比较3组对象外周血中FRα+CTCs水平，分析NSCLC患者外周血中FRα+CTCs水平与性别、年龄、吸烟史（从不吸烟或平均吸烟少于1次/月定义为不吸烟）、肿瘤组织类型、分化程度、大小、淋巴结转移、临床分期等临床特征的关系。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0统计软件。非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验。采用ROC曲线评估FRα+CTCs水平鉴别诊断NSCLC组和良性对照组、NSCLC组和阴性对照组的效能，并计算灵敏度、特异度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组对象外周血中 FRα+CTCs水平的比较NSCLC组外周血中FRα+CTCs水平为12.31（9.48，16.52）FU/3 ml，良性对照组为 6.23（4.90，8.30）FU/3 ml，阴性对照组为 5.50（4.54，7.82）FU/3 ml，NSCLC 组外周血中FRα+CTCs水平较良性对照组和阴性对照组明显升高（Z=-7.021、-7.262，均 P＜0.01），而后两者间比较差异无统计学意义（Z=-1.291，P＞0.05）。

2.2 NSCLC患者FRα+CTCs水平与临床特征的关系FRα+CTCs水平与NSCLC患者临床病理特征之间的关系见表1。结果发现，FRα+CTCs水平仅与NSCLC患者肿瘤临床分期有关（P＜0.05），与性别、年龄、吸烟史、肿瘤组织类型、分化程度、大小、淋巴结转移均无关（均 P＞0.05）。

表1 NSCLC患者FRα+CTCs水平与临床病理特征的关系（FU/3ml）

2.3 FRα+CTCs水平用于诊断NSCLC的效能 ROC曲线分析表明，FRα+CTCs水平是NSCLC的潜在肿瘤标志物。FRα+CTCs用于鉴别诊断NSCLC组和良性对照组、NSCLC组和阴性对照组的AUC值分别为0.811（95%CI：0.746～0.875）和 0.820（95%CI：0.758～0.885）。此外，取Youden指数最大值，最佳截断值为9.370FU/3 ml，FRα+CTCs诊断NSCLC组和良性对照组的灵敏度为0.758，特异度为0.917；最佳截断值为9.495 FU/3 ml，FRα+CTCs诊断NSCLC组和阴性对照组的灵敏度为0.752，特异度为0.917。见图1。

图1 FRα+CTCs用于诊断NSCLC效能的ROC曲线

3 讨论

FRα是糖基化磷脂酰肌醇锚定糖蛋白，在多种癌症中高表达，如头、颈部肿瘤[4]，乳腺癌和卵巢癌[5]以及NSCLC[6]。有研究表明，72%～83%的肺腺癌患者在细胞膜上过度表达FRα，但在正常成人组织中表达有限[7]。因此，采用检测外周血FRα+CTCs可有效避免EpCAMCTCs的丢失，提高诊断有效率。

本研究发现，NSCLC组外周血FRα+CTCs水平高于良性对照组和阴性对照组（均P＜0.01），而后两者间比较差异无统计学意义（P＞0.05），这表明外周血FRα+CTCs水平可能是监测肺部疾病恶化的潜在肿瘤标志物。进一步分析NSCLC患者FRα+CTCs水平与临床病理特征之间的关系，发现FRα+CTCs水平与NSCLC患者的性别、年龄、吸烟史、肿瘤组织类型、分化程度、大小、淋巴结转移均无关（均P＞0.05），但与NSCLC的临床分期有关（P＜0.05）。Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者FRα+CTCs水平显著高于Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者，该结果提示，随着NSCLC病程的进展，外周血中更易检测到FRα+CTCs，此结果与Chen等[8]报道类似。笔者认为，这可能与肿瘤细胞的侵袭性有关，在肿瘤进展的中晚期，有更多的侵袭性、转移性强的CTCs播散到血液中，从而检测水平更高。

由于缺乏特异性的CTCs检测标志物，目前常用检测主要基于肿瘤细胞表面EpCAM的表达来分离CTCs，并对其进行计数。然而这一方法可能明显低估了CTCs的数量。尹寒露等[9]采用阴性-磁性法分离和富集CTCs，经EpCAM免疫荧光染色后，流式细胞仪鉴定CTCs并计数，结果显示47例患者的血液样品中，EpCAM+CTCs的检出率仅为48.9%[8]。本研究中，ROC曲线分析表明，FRα+CTCs诊断NSCLC组和良性对照患者的最佳截断值为9.370 FU/3 ml，AUC值为0.811（95%CI：0.746～0.875），灵敏度为 0.758，特异度为0.917；FRα+CTCs鉴别诊断NSCLC组和阴性对照的最佳截断值为 9.495 FU/3 ml，AUC 值为 0.820（95%CI：0.758～0.885），灵敏度为 0.752，特异度为 0.917。该结果提示，采用检测FRα+CTCs水平可有效提高NSCLC的诊断率，是其潜在有效的诊断标志物。

综上所述，检测外周血FRα+CTCs水平是一种简单、无创可用于NSCLC鉴别诊断的方法，但由于本研究的样本量较小，应进一步招募更多的NSCLC患者样本以证实本研究结果，如能采用联合EpCAM+CTCs和FRα+CTCs水平检测，将会为NSCLC非侵入性诊断提供更多重要的信息。