胰岛素样生长因子结合蛋白4在非小细胞肺癌中的表达及作用

赵嘉璐 李伟文 蓝伟红 蓝秀 熊雪芳 孙蕾

肺癌是一种预后极差的高度恶性肿瘤疾病，按照WHO肺癌的病理学分类可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，而非小细胞肺癌在临床中更为常见[1]。近些年来，无论是外科技术的提高或放化疗方案的优化，还是针对肺癌驱动基因的分子靶向治疗的问世，包括已经进入临床应用的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）等，都未能使肺癌患者的5年生存率明显提高（仍然低于15%）[2]，因此寻找新的治疗靶点和疗法对提高患者生存率有着重要意义。

胰岛素样生长因子（IGF）在调节细胞生长、分化和恶性转化方面起着至关重要的作用，其生物活性受胰岛素样生长因子结合蛋白家族（insulin-like growth factor binding protein，IGFBPs）调节。胰岛素样生长因子结合蛋白4（IGFBP-4）为最小的IGFBP，是一个重要的抑制蛋白，与IGF具有高亲和力[3]，近些年的大量研究表明，IGFBP-4在多种肿瘤的生长调控中都表现出了极其重要的作用，其主要通过结合组织自分泌的IGF从而抑制肿瘤的生长[4-8]。目前，IGFBP-4在肺癌中的表达及作用尚不清楚。本研究通过检测非小细胞肺癌组织中IGFBP-4的表达情况，并观察其对非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响，初步探讨其可能的作用机制，为肺癌的治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 非小细胞肺癌A549细胞购自上海中科院细胞库。A549细胞置于含10%FBS、1%双抗的RPMI 1640培养基中，在37℃、5% CO2培养箱中培养。人重组 IGFBP-4（美国 R&D 公司，批号：804-GB），BCA蛋白浓度测定试剂盒、预染蛋白质Marker、膜封闭液和ECL发光液（美国Thermo公司）。兔抗人IGFBP-4单抗（美国R&D公司，批号：AF804），鼠抗人Fibronectin单抗（美国Santa公司），鼠抗人c-fos单抗（英国Abcam公司），鼠抗人β-actin单抗、HRP标记的山羊抗鼠二抗和山羊抗兔二抗（中国联科生物公司）。CCK-8试剂盒（日本Dojin公司）。

1.2 组织样本采集 收集丽水市中心医院2008年1月至2020年1月行手术治疗的20例非小细胞肺癌患者的肺癌组织和正常肺组织（肿瘤边缘5 cm外的肺组织，并经组织病理切片检查证实），组织样本均为手术后立即采集，所有患者术前均未进行化疗或放疗。组织病理类型的判断标准参照WHO肺癌的病理学分类。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.3 细胞增殖活性检测 采用CCK-8法。使用96孔平底细胞培养板，各孔接种A549细胞浓度为2 000个。将A549细胞分为Control组和不同浓度IGFBP-4（5、50、500 ng/ml）处理组。4组细胞经无血清培养液饥饿培养24 h后，Control组不做任何处理，其余3组采用不同浓度的IGFBP-4处理细胞，分别在1、2、3和4 d时加入10 μl CCK-8溶液，将培养板置于培养箱内孵育2 h，酶联免疫检测仪下选择波长450 nm测定各孔吸光度，根据各组细胞的吸光度值绘制4 d的细胞生长曲线。选出细胞增殖活性最佳的细胞组进行以下实验。

1.4 细胞集落形成 采用平板克隆实验。将A549细胞以500个细胞的密度分别接种含10 ml培养液的培养皿中，用IGFBP-4 500 ng/ml处理，并在RPMI1640中孵育14 d形成细胞集落。采用考马斯蓝染色后对细胞集落进行成像，计算克隆形成的细胞集落数量。实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞迁移能力和侵袭能力的检测

1.5.1 细胞迁移能力检测 采用Transwell实验检测。消化A549细胞，离心（800 r/min）弃上清液，用含BSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度至1×105个/ml。取细胞悬液200 μl加入Transwell小室，24孔板下室加入800 μl含10%FBS的1640培养基，置培养箱培养20 h后取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定后0.1%结晶紫染色，用棉签擦去上层未迁移细胞，随机观察6个视野细胞并计数。实验重复3次，取平均值。

1.5.2 细胞侵袭能力检测 采用Transwell实验检测。将 Matrigel 1∶3稀释，取10 μl铺于 Transwell小室底部膜的上室面成胶。消化A549细胞，离心（800 r/min）弃上清液，用含BSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度至1×105个/ml。取细胞悬液 200 μl加入 Transwell小室，24孔板下室加入800 μl含10%FBS的1640培养基，置培养箱培养24 h后取出 Transwell小室，4%多聚甲醛固定后0.1%结晶紫染色。用棉签擦去上层未迁移细胞，随机观察 6个视野细胞并计数。实验重复3次，取平均值。

1.6 IGFBP-4、Fibronectin和c-fos表达水平检测 采用 Western blot法。收集肺癌组织（T）、正常肺组织（N）标本及A549细胞（Control组和IGFBP-4组），提取蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。每组取40 μg蛋白样品经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭，一抗4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，加二抗室温孵育，再用TBST缓冲液洗膜，ECL化学发光显色，凝胶成像系统自动曝光，检测IGFBP-4、Fibronectin和c-fos蛋白的表达水平。实验重复4次，取平均值。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IGFBP-4在肺癌组织中的表达 IGFBP-4在肺癌组织中的表达水平为0.50±0.19，正常组织中表达水平为1，IGFBP-4在肺癌组织中的表达水平明显低于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 肺癌组织和正常组织IGFBP-4表达的电泳图

2.2 IGFBP-4对A549细胞增殖的影响 生长曲线显示，A549细胞经50、500 ng/ml IGFBP-4处理后增殖活性明显低于 Control组（均 P＜0.05），见图 2a。与Control组相比，用500 ng/ml IGFBP-4处理的A549细胞中形成的细胞集落数量为（65.33±17.47）个，明显低于 Control组的（149.66±25.50）个，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 2b。

图2 IGFBP-4对A549细胞增殖的影响（a：4组细胞的生长曲线，与Control组比较，*P＜0.05；b：两组细胞集落数量的比较）

2.3 IGFBP-4对A549细胞迁移和侵袭能力的影响与Control组比较，用500 ng/ml IGFBP-4处理的A549细胞的迁移和侵袭能力明显降低（均P＜0.05），见图3（插页）、表1。

表1 两组细胞迁移和侵袭能力的比较（个）

图3 A549细胞迁移和侵袭图像（a：细胞迁移；b：细胞侵袭；结晶紫染色，×200）

2.4 IGFBP-4对A549细胞Fibronectin和c-fos蛋白表达水平的影响 在500 ng/ml IGFBP-4处理48 h后，与Control组相比，IGFBP-4下调Fibronectin和c-fos蛋白的表达水平（均 P＜0.05），见图 4、表 2。

图4 两组细胞Fibronectin和c-fos蛋白表达的电泳图

表2 两组细胞Fibronectin和c-fos蛋白表达水平的比较

3 讨论

IGFBPs由6种不同的蛋白成员（IGFBP1-6）组成，对IGF-1和IGF-2有很高的抑制作用[9]。IGFBP-4作为最小的成员，已被证实是一个重要的抑制蛋白，与IGF具有高亲和力[3]，存在于所有的生物体液中，由不同类型的细胞合成以自分泌或旁分泌的形式发挥作用，其生理功能主要由参与调解IGF的经典途径和不依赖于IGF的非经典途径构成[10]。IGFBP-4主要是与胰岛素样生长因子受体（IGFR）竞争结合IGF而调节IGF的生物学作用，从而在各种生理和病理过程中发挥重要作用，大量研究的显示，其主要通过结合IGF从而发挥抗肿瘤作用[4-8]。

作为IGFBPs的一个重要成员，IGFBP-4已成为许多恶性肿瘤研究的热点[3，11-12]。研究表明，IGFBP-4可以抑制结直肠癌、乳腺癌和胶质母细胞瘤细胞的生长[13-15]。虽然IGFBP-4作为抑癌基因被逐渐认识，但其在肺癌组织中的表达及作用机制尚不明确。本研究采用Western blot法检测20例肺癌组织及邻近正常组织中IGFBP-4蛋白的表达情况，结果显示IGFBP-4在肺癌组织中的表达明显下调，且前期研究表明IGFBP-4能促使肺癌细胞凋亡[16]，结果提示在肺癌的发生、发展过程中IFGBP-4可能扮演着重要角色。同时，笔者观察IGFBP-4对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响，结果发现，经IGFBP-4处理的A549细胞的增殖活性、迁移和侵袭能力明显低于Control组，说明IGFBP-4在肺癌中可能作为抑癌基因抑制肺癌细胞的生长。

Fibronectin即纤粘连蛋白，是一种与肿瘤的复发、转移密切相关的重要的细胞蛋白。Fibronectin的表达随着肿瘤恶性程度的增高而增强，与肿瘤的分级及预后有关[17-18]。众所周知，c-fos原癌基因被描述为一种即时的早期反应基因，其中c-fos的高表达可诱导肿瘤的形成，反映细胞的增殖活性，与肿瘤细胞的浸润、转移及预后相关[19]。进一步研究发现，IGFBP-4显著降低Fibronectin和c-fos蛋白的表达，这些结果表明IGFBP-4可能是肺癌发生、发展中潜在的负调节因子，通过下调Fibronectin和c-fos表达在肺癌的增殖中起着关键作用。

总之，本实验通过检测IGFBP-4在肺癌组织中的表达，发现IGFBP-4在肺癌组织中的表达明显降低，发现IGFBP-4抑制肿瘤细胞增殖的分子机制可能主要通过下调Fibronectin和c-fos的表达，说明IGFBP-4在非小细胞肺癌细胞中具有较强的抗肿瘤作用，并可能为未来肺癌的治疗提供新的思路。