肺胀2号方对COPD体外细胞模型分泌IL-8、MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1的影响

2022-05-05柯庚申洪春霖洪敏俐黄锦榕苏宝连陈慧暖

福建中医药 2022年4期

柯庚申，洪春霖，洪敏俐，黄锦榕，苏宝连，陈慧暖

（福建中医药大学附属漳州中医院，福建漳州 363000）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以进行性的、不完全可逆的气流限制为特征的慢性气道疾病，发病率高，且严重影响患者的生命质量［1］。肺胀2 号方是福建中医药大学附属漳州中医院洪敏俐主任所拟定的协定方，主要治疗COPD 稳定期肺肾气阴两虚证，具有补肺滋肾、益气养阴、纳气平喘之功。课题组前期研究显示该方具有抗氧化、改善COPD 评估测试（CAT）评分及中医证素积分、提高患者生活质量等效果［2-4］。本次研究通过香烟烟雾提取物（CSE）刺激人支气管上皮细胞（16HBE）建立体外COPD 模型，探讨肺胀2 号方对16HBE 分泌IL-8、MMP-9、TIMP-1 的影响，探讨肺胀 2 号方治疗COPD 的作用机制。

1 材料

1.1 细胞株 16HBE（上海中乔新舟生物科技有限公司，货号：ZQ0001）。

1.2 实验药品肺胀2 号方（漳州片仔癀药业有限公司，批号：201509001，规格：每片0.5 g，每片含生药量1.476 g）；地塞米松磷酸钠注射液（广州白云山天心制药股份有限公司，批号：2101191B6，规格：5 mg/mL）。

1.3 主要试剂及仪器玉溪牌香烟［红塔烟草（集团）有限责任公司］；0.25%Trypsin-EDTA（美国Ther‑mo Fisher 公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）、RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素均购自美国HyClone 公司；6 孔细胞培养板（无锡耐思生物科技有限公司）；细胞培养瓶（美国康宁公司）；微孔滤膜（德国默克Millpore有限公司，规格：0.22µm）；ELISA 试剂盒（上海酶联生物技术有限公司）；生物安全柜（力康生物医疗科技控股有限公司）；CO2孵育箱及低温离心机（美国Thermo Fisher 公司）；酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）。

2 方法

2.1 肺胀2 号方溶液制备参考本课题组前期研究的方法［5］：将肺胀2 号方药片研成粉末，溶解于PBS液中，放入离心机，以1 000 rpm 速度离心3 min，弃去无法溶解的药片残渣，取上清液，加PBS 使肺胀2 号方溶液浓度为5 mg/mL（相当于生药质量14.76 mg/mL），经微孔滤膜过滤后放置于-80℃冰箱冻存备用。

2.2 完全培养基制备取RPMI-1640 细胞培养基500 mL，加入FBS 50 mL、1%青霉素/链霉素5.5 mL混合而成。

2.3 CSE 原液制备参照 MARCH 等的方法［6］制备：用1 支去过滤嘴香烟，点燃后经负压吸引装置连续抽吸，吸入的烟雾导入25 mL 完全培养基中，密闭摇匀，用 5%NaHCO3调整 pH 至 7.4，经微孔滤膜过滤，得到的悬液即为100%CSE 原液。

2.4 16HBE 细胞传代培养将16HBE 细胞放置于完全培养基中，在37℃、5%CO2培养箱中静置培养，每3 d 更换一次完全培养基。当细胞贴壁生长至80%左右的汇合度时，弃去培养液，加入0.25%Trypsin-EDTA 于培养箱中消化3 min 后，加入完全培养基终止消化，在1 000 rpm、4℃的离心机中离心3 min，弃上清液，加入适量完全培养基，并予加液枪反复轻柔吹打，制成16HBE 细胞悬液。

2.5 CSE 适合浓度筛选将16HBE 细胞悬液以1×105/孔接入6 孔细胞培养板培养，每孔2.5 mL，当细胞贴壁生长至60%左右的汇合度时，吸掉旧的培养基，分别加入 2.5%、5%、10%、20%、50%CSE 2.5 mL，放入37℃、5%CO2培养箱中孵育 24 h，MTT法检测细胞存活率筛选合适的烟雾造模浓度。由表 1 可知：2.5%CSE 刺激的 16HBE 细胞存活率为（81.33±2.02）%，是各浓度最高，故选取2.5%CSE为适合的造模浓度。

表1 不同浓度 CSE 干预后 16HBE 细胞存活率情况（）

注：与空白组比较，1）P＜0.01。

细胞存活率/%94.33±0.88 81.33±2.021）32.67±1.201）12.33±1.451）4.00±0.581）1.33±0.331）CSE浓度0%2.5%5%10%20%50%

2.6 16HBE 分组培养确定合适的烟雾造模浓度后，参照“2.4”步骤重新制成16HBE 细胞悬液，将16HBE 细胞悬液分为 6组，分别为空白组、CSE组、地塞米松组及肺胀2 号方低、中、高剂量组，每组设计 3 个复孔，每孔 2.5 mL，以1×105/孔接入 6 孔细胞培养板于37℃、5%CO2培养箱中孵育，当细胞贴壁生长至60%左右的汇合度时，吸掉旧的培养基后加入药物干预。加药方法：①空白组，加入完全培养基 2.5 mL；② CSE组，取 5 mL 100%CSE 加入完全培养基15 mL，稀释成2.5%CSE，每孔加入2.5%CSE 2.5 mL；③地塞米松组，取5 µL 地塞米松磷酸钠注射液加入25 mL 2.5%CSE中，得到终浓度为2.5%CSE、0.001 mg/mL 地塞米松磷酸钠混合液，每孔加入混合液2.5mL；④ 肺胀2 号方低、中、高剂量组，采用倍比稀释法，用完全培养基将100%CSE 及5 mg/mL肺胀2号方溶液分别稀释成浓度为5%CSE 及0.125、0.25、0.5 mg/mL 肺胀 2 号方稀释液，再将 5%CSE 分别和等体积的 0.125、0.25、0.5mg/mL 肺胀 2 号方稀释液混合，即得到终浓度为2.5%CSE 和0.0625、0.125、0.25 mg/mL 肺胀 2 号方混合液，每孔分别加入上述混合液2.5 mL。加药后继续于CO2孵育箱中静置培养24 h，收集上清液备用。

2.7 细胞形态观察及细胞存活率检测各组收集上清液后，采用光学显微镜下观察剩余贴壁细胞的细胞形态并拍照，再采用MTT 法检测细胞存活率。

2.8 IL-8、MMP-9、TIMP-1 水平及 MMP-9/TIMP-1测定采用双抗体夹心ELISA 法检测上清液中IL-8、MMP-9、TIMP-1 水平。

2.9 统计学方法采用SPSS 22.0 软件进行数据分析。计量资料属正态分布以（）表示，2组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析检验。

3 结果

3.1 各组光镜下细胞形态比较见图1。空白组细胞呈不规则多边形，连接紧密；CSE组细胞部分形态变圆，间隙变大，细胞较稀疏，部分细胞皱缩成团，考虑细胞生长受抑制；地塞米松组与各剂量组细胞生长受抑制情况均较前改善，有较多细胞恢复到多边形形态，细胞存活率明显升高，特别是中剂量组，细胞形态与空白组差异不大。见图1。

图1 各组光镜下细胞形态比较（×100）

3.2 各组细胞存活率比较见表2。

表2 各组细胞存活率比较（）

注：与空白组比较，1）P＜0.01；与CSE组比较，2）P＜0.01；与地塞米松组比较，3）P＜0.05。

细胞存活率/%93.67±0.88 80.67±0.881）87.00±1.531）2）88.33±0.881）2）90.67±0.881）2）3）88.00±0.581）2）组别空白组CSE组地塞米松组低剂量组中剂量组高剂量组

3.3 各组上清液IL-8、MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1 比较见表3。

表3 各组上清液 IL-8、MMP-9、TIMP-1 水平及 MMP-9/TIMP-1 比较（）

注：与空白组比较，1）P＜0.01；与CSE组比较，2）P＜0.01，3）P＜0.05。

MMP-9/TIMP-1 8.73±0.88 13.80±0.731）11.06±1.59 8.61±0.942）10.08±0.363）9.46±0.702）组别空白组CSE组地塞米松组低剂量组中剂量组高剂量组IL-8/（pg/mL）161.04±5.66 248.65±18.891）191.19±26.633）181.56±19.993）168.10±6.902）182.85±8.753）MMP-9/（ng/mL）25.00±0.41 30.03±1.221）27.48±0.73 25.39±0.953）24.66±0.752）25.11±1.882）TIMP-1/（µg/L）2.92±0.27 2.18±0.04 2.56±0.28 3.00±0.25 2.45±0.07 2.68±0.27

4 讨论

吸烟是COPD 最重要的环境发病因素。相关研究［7］表明：CSE 中含有的数千种化学物质，除可直接对气道上皮细胞和肺泡细胞产生损伤之外，还可激活多种信号通路，趋化大量炎症因子释放，引起蛋白酶和抗蛋白酶失衡，进而导致肺实质破坏、小气道狭窄和气道重构，最终造成持续气流受限。气道上皮细胞是呼吸道最先遭受外界有害物质刺激的地方，也是各种呼吸道疾病的病理基础起始环节。因此，本研究采用烟雾刺激16HBE 细胞进行造模并进行后续相关研究。目前，国内外关于COPD 体外细胞模型的研究较少，宋雪慧等［8］采用2%～30%不同浓度的CSE 进行造模，最后结果显示CSE 浓度大于12%时细胞存活率过低，适宜造模浓度为2%～12%左右，并将细胞存活率约为70%时的4%CSE 浓度作为造模适合浓度。侯红平等［9］研究表明CSE 刺激肺泡上皮细胞的适合浓度为10%。本研究CSE 适合浓度筛选结果显示：随着CSE 浓度升高，其对16HBE 细胞的损害越大，5%以上CSE 刺激后细胞存活率太低，而2.5%CSE 刺激的16HBE 细胞存活率在80%以上，且原本连接紧密的细胞间隙变大，形态变圆，细胞较稀疏，说明烟草烟雾具有显著的细胞毒性，因此，认为COPD 体外细胞模型造模成功。

慢性气道炎症贯穿COPD 发生、发展的全过程，各种各样的细胞因子如促炎细胞因子、生长因子、趋化因子、淋巴因子等都是炎症反应的参与者［10］。IL-8 是炎症反应过程中的强效趋化因子，是引发、维持并加重气道炎症的一种重要的细胞因子［11］。它能够趋化并激活炎症细胞特别是中性粒细胞向炎症部位聚集，抑制中性粒细胞降解，加强其吞噬作用及溶酶体酶活性，促使炎症细胞释放多种炎症因子及蛋白酶，进而引发气道、肺组织损伤等一系列病理改变［12］。气道重构是COPD 发生、发展的另一重要机制，主要表现在肺实质的肺气肿和小气道阻塞，而呼吸道细胞外基质（ECM）的降解沉积失衡在气道重构的过程中发挥了重要作用。MMP-9 及其天然抑制物TIMP-1 是调节ECM 稳定的主要酶类。正常组织MMP-9 表达很少，当受到刺激时，MMP-9 在多种肺实质细胞如支气管上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等可广泛表达，降解几乎所有的ECM，并趋化炎性细胞，对肺组织产生严重的破坏［13］。TIMP-1 是 MMP-9 的天然抑制物，可特异性抑制MMP-9 的活性。两者比例失衡，无论是升高或者降低均可导致细胞外基质合成和降解失衡，引起气道重塑［14］。

肺胀2 号方具有补肺滋肾、益气养阴、化痰祛瘀之功，前期研究已证实其在临床应用中的良好疗效［2-4］，本研究发现：CSE组上清液 IL-8、MMP-9 水平明显升高，TIMP-1 水平降低，MMP-9/TIMP-1 较空白组明显升高，表明16HBE 细胞群处于蛋白酶-抗蛋白酶失衡及炎症反应状态中，与COPD 的病理状态类似。药物干预后，地塞米松组及各剂量组均可有效改善16HBE 细胞形态，提高细胞存活率，降低IL-8水平；但同地塞米松组比较，各剂量组MMP-9 水平也得到有效降低，MMP-9/TIMP-1 降至接近空白组水平，提示各剂量组可以多途径、更有效地改善COPD 体外细胞模型蛋白酶-抗蛋白酶失衡及炎症反应的病理状态。其中，中剂量组IL-8、MMP-9 水平最低，细胞形态及细胞存活率最佳，提示中剂量浓度可能是肺胀2 号方最适宜的治疗浓度。

综上，肺胀2 号方治疗COPD 机制可能与下调IL-8 分泌、抑制MMP-9 过度表达、改善MMP-9/TIMP-1 平衡，从而降低COPD 慢性气道炎症，改善ECM 降解、沉积失衡，减轻气道重构有关。