基于PERK通路探讨荣筋拈痛方对软骨细胞内质网应激反应抑制作用

付长龙 ，谢新宇 ，何俊君 ，邱志伟 ，郑春松 ，叶锦霞 ，马德尊 *

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122；3.福建中医药大学杂志社，福建 福州 350122）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）严重危害中老年人群的生命健康，关节软骨渐进性退变是导致 KOA 的关键病因［1-2］。临床中 KOA 患者常伴有患处关节的反复疼痛、屈伸活动不利等症状，病情进展至疾病后期还可出现关节活动受限乃至致残［3-4］，因此，延缓关节软骨细胞退变，防止病情进一步发展，是治疗KOA 的重要举措。研究发现PERK 信号通路介导的软骨细胞内质网应激（ERS）是影响KOA 软骨退变的重要环节之一［5-6］，但从miRNA-377-3p 调控PERK 信号通路关联的内质网降解增强子（EDEM1）、蛋白激酶R 样内质网激酶（PERK）、转录激活子4（ATF4）、免疫球蛋白重链结合蛋白（BIP）与 DNA 损伤诱导基因 153（GADD 153）角度，探讨荣筋拈痛方（RJNTD）延缓 KOA 软骨细胞退变的作用机制尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 毒胡萝卜素（TG，美国Sigma公司，批号：0000120608）；显影超敏试剂盒（中国亚科因生物技术有限公司，批号：ATTAU1101）；EDEM1（批号：00041108）、PERK（批号：00088211）、Ⅱ型胶原组化抗体（批号：00010731）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；即用型免疫组化试剂盒（福州市迈新生物技术开发有限公司，批号：1908219706C）；ATF4（批号：9N29）、BIP（批号：9N29）、GADD153（批号：4612）、GAPDH（批号：9306）均购自美国SAB 公司；通用型高灵敏度染料法定量PCR 检测试剂盒（中国诺唯赞生物技术有限公司，批号：7E570A1）；Nano‑Drope 2000 微量紫外分光光度计（赛默飞世尔科技中国有限公司）；CFX96 荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）；引物设计与合成：miRNA-377-3p（上游：CCGCGATCACACAAAGGCAAC，下游：AGTGC AGGGTCCGAGGTATT）、U6（上游：CTCGCTTCGGC AGCACATATACT，下游：ACGCTTCACGAATTTGCG TGTC）均购自福州尚亚生物技术有限公司。

1.2 药物 荣筋拈痛方冻干粉购自江阴天江药业有限公司，生产批号：2006001，药物安全性及质量控制检测均已完成。

1.3 实验动物 健康SPF 级雄性C57BL/6 小鼠30只，4周龄，体质量（15±3）g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005。清洁级医学实验动物环境设施由福建中医药大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2019-0007。实验动物按标准饲料喂养，自由饮水。实验过程及方法均符合福建中医药大学实验动物伦理委员会要求。

2 实验方法

2.1 软骨细胞培养、鉴定 小鼠经5.0%异氟醚麻醉下处死，无菌条件下体外分离双膝软骨，PBS 洗涤3次，随后经0.2%Ⅱ型胶原酶消化获得原代软骨细胞。原代软骨细胞培养到第9天后进行传代培养，获得一代软骨细胞。按照前期研究基础对一代软骨细胞进行Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色鉴定［7］，在无菌玻片上用4%多聚甲醛固定细胞，加入软骨素酶 ABC 后室温孵育 30 min，PBS 漂洗，5 min/次，共3次，加入5% BSA 室温孵育30 min。加入Ⅱ型胶原组化抗体反应30 min，PBS 洗涤后在50 µL DAB 浸润10 min；依次经过苏木素复染、冲洗与反蓝，最后对标本进行晾干、脱水、封片和显色拍照。观察到细胞核出现蓝染，其胞浆区呈现棕黄色，表明提取的细胞为软骨细胞，无杂质细胞，纯度良好。

2.2 实验分组及干预措施 将软骨细胞以20万/孔接种于6 孔板中，用含10%胎牛血清低糖DMEM 培养液置于5%CO2培养箱中常规培养。将细胞随机分成空白组、对照组、模型组和中药组，细胞汇合至80%时开始干预。空白组常规培养4 h，对照组常规培养4 h 后更换300 µg/mL RJNTD 培养液培养12 h，模型组用 25 µmol/L TG 培养液培养 4 h 后改为常规培养，中药组用25 µmol/L TG 培养液培养4 h 后更换300 µg/mL RJNTD 培养液培养12 h。

2.3 Real-time PCR 检 测 miRNA-377-3p 相 对 表 达水平 各组干预后采用Trizol 法提取软骨细胞中的总RNA；微量紫外分光光度计检测各组样本RNA浓度，并检测260 nm 与280 nm 处吸光度，计算比值。采用茎环法反转录miRNA。根据反转录试剂盒说明书，取1µg 总RNA 反转录成cDNA，反转录条件：55℃ 15 min，85℃ 5 s。以 1 µL cDNA 为模板扩增miRNA-377-3p。扩增反应条件：95℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40 个循环。以 U6 为内参照基因，计算各目的基因 2-∆∆Ct，比较分析 miRNA-377-3p相对表达水平。

2.4 Western blot 检测软骨细胞中 EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD153 蛋白表达水平 干预后提取各组软骨细胞总蛋白，BCA 法进行蛋白定量，配制12%分离胶和5% 浓缩胶，上样后进行电泳，采用半干法转膜，封闭液封闭2 h 后洗膜，再将各条膜放入预先配置好的EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD 153 的一抗后，置于4 ˚C 冰箱摇床过夜充分震荡反应，待二抗反应处理后，使用ECL 发光液进行显影，于凝胶成像仪下曝光成像，后分析储存。

2.5 统计学方法 采用SPSS 26.0 软件对实验数据进行处理。计量资料符合正态分布采用（）表示，采用单因素方差分析。

3 结 果

3.1 各组miRNA-377-3p 相对表达水平比较 见图1。

图1 各组miRNA-377-3p 相对表达水平比较图

3.2 各组 EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD153 蛋白表达水平比较 见图2。

图2 各组EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD153 蛋白表达水平比较图

4 讨 论

KOA 以“膝骨痹”特征起病，其主要病机为肝肾亏虚为本，风寒湿邪为标［8］，治当补肝肾、祛风湿。荣筋拈痛方具有补肝肾、祛风湿、除痹痛之功，临床治疗KOA 具有良效［9］。课题组前期研究证实：荣筋拈痛方可促进软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白表达，并促进软骨细胞增殖，进而延缓软骨细胞退变［10］。

关节软骨渐进性退变是KOA 的关键病因，而关节软骨细胞发生内质网应激反应（ERS）与KOA软骨退变密切相关［11］。研究发现：KOA 发生后，miRNA-377-3p 在KOA 相关组织中表达呈降低趋势［12］，且在软骨细胞中过表达 miR-377-3p 可促进软骨细胞增殖，降低炎症反应，并减轻软骨细胞退变程度［13］。内质网应激发生后，与BiP 解离的PERK 寡聚后发生磷酸化，可促进ATF4 表达，上调EDEM1 与GADD153 表达，最终促使软骨细胞凋亡发生［14-16］。前期我们通过StarBase 数据库检索筛选基因结合位点，发现miR-377-3p 与EDEM1 具有结合位点。EDEM1 作为内质网应激中的重要基因，可促进蛋白质降解从而缓解内质网应激反应［17-18］，推测miRNA-377-3p 可调控PERK 信号转导通路，且是影响KOA 软骨退变的重要环节［19-20］。

本研究实验结果显示：荣筋拈痛方干预TG 诱导的软骨细胞后，细胞中miR-377-3p 基因表达上调，内质网应激反应PERK 信号通路相关蛋白EDEM1、PERK、ATF4、BIP、GADD153 异常增高的蛋白表达水平下降，表明荣筋拈痛方可以有效缓解软骨细胞内质网应激，发挥延缓软骨退变的作用，其机制可能与miR-377-3p 调控内质网应激相关蛋白有关。