高产己酸梭状芽孢杆菌的诱变及筛选育种

屈 慧，王海英，王 慧，徐 芳，屈 宇，郝祯燕

（1.河套酒业集团股份有限公司技术中心，内蒙古巴彦淖尔 015400；2.临河区人民医院，内蒙古巴彦淖尔 015000；3.临河区动物疫病预防控制中心，内蒙古巴彦淖尔 015000）

己酸菌是窖泥中的主要功能性微生物，而窖泥在北方浓香白酒发酵中起到了举足轻重的作用。故己酸菌在白酒发酵中享有不可或缺的地位。

己酸菌就本身特性而言属于比较“娇气”型菌种，在发酵的过程中对发酵条件的要求比较严苛，且具有自身容易老化衰退、种间差异性较大等特点。这就需要科研人员对己酸菌进行持续的、更加深入的研究。

针对己酸菌以上特性，选择实验室保藏菌种209#己酸菌作为出发菌株，采取物理和化学相结合的方法进行诱变，筛选出发生正向突变的菌株。同时对筛选到的菌株进行遗传性状稳定性的检测和代谢产物变化规律的跟踪分析。确保诱变后的菌种遗传性状稳定，产物代谢规律清晰。作为生产使用菌种应用到大生产中，以达到提高酿酒材料中己酸乙酯的目的。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 菌种

实验室保藏菌种209#己酸菌。

1.1.2 培养基

巴氏（改良）培养基：无水乙酸钠0.5%、酵母浸粉0.4 %、硫酸铵0.05 %、磷酸氢二钾0.04 %、硫酸镁0.02%、酒精2%、碳酸钙1%、pH 值6.5～7.0、蒸馏水1000 mL。121 ℃高压灭菌30 min。（备注：碳酸钙干热灭菌，酒精在接种前加入。）

己酸菌富集培养基：氯化镁200 mg、硫酸锰2.5 mg、硫酸亚铁5 mg、生物素5 μg、乙酸钠8 g、氯化铵500 mg、硫酸钙10 mg、钼酸钠2.5 mg、对氨基苯甲酸100 μg、乙醇25 mL、营养琼脂20 g、蒸馏水1000 mL。pH 值自然，121 ℃灭菌20 min，冷却后无菌加入25 mL乙醇。

车间生产工艺培养基：三水醋酸钠1.5%、酵母粉0.6%、硫酸铵0.05%、磷酸氢二钾0.04%、硫酸镁0.02 %、土1.5 %、酒精2 %、碳酸钙0.5 %、pH 值自然、纯净水1000 mL；罐体及物料蒸汽灭菌30 min。酒精接种时加入，34 ℃培养7 d。

1.1.3 仪器设备

电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）、生物安全柜（苏州市金净净化设备科技有限公司）、奥林巴斯BX51 显微镜（奥林巴斯（北京）销售服务有限公司）、数显电热恒温培养箱（上海博迅实验有限公司）、医用冷藏箱（中科美菱低温科技有限责任公司）、立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、YQX 型厌氧培养箱（上海跃进医疗器械厂）、岛津GC-8A 气相色谱仪、单道可调量程移液枪（普德兰上海贸易有限公司）等仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

1.2.1.1 菌种复壮

对保藏菌种209#己酸菌进行热处理。处理条件为80 ℃，水浴振摇处理10 min，冷却至室温后转接于新鲜富集培养基中，34 ℃培养5～7 d。

1.2.1.2 菌种继代培养

对复壮的菌种进行2 次继代培养。培养基使用巴氏改良培养基，34 ℃培养5～7 d。让菌种活力和健壮程度达到最佳，菌体浓度达到×10。

1.2.2 菌种诱变

1.2.2.1 紫外线诱变

1.2.2.1.1 菌悬液制备

吸取5 mL 菌液，5000 r/min，离心10 min，弃去上清液，加入5 mL 生理盐水振荡均匀后再离心弃去上清液，如此反复2 遍。第3 遍时加入5 mL 生理盐水充分振荡均匀待用（备注：菌液洗脱需在超净工作台中操作）。

1.2.2.1.2 诱变条件

19 W紫外灯、波长245 nm、照射距离38 cm、照射时间2 min、4 min、6 min。

1.2.2.1.3 诱变步骤

诱变前采用平板计数法对制备好的菌悬液进行菌落计数，将1.2.2.1.1 制备好的菌悬液倒入φ=90 mm 的无菌平皿中，使用无菌接种环将其均匀涂开，使液体平铺于皿中，提前15 min 预热的紫外灯垂直照射于菌液。在整个诱变过程中不能照射白炽光。诱变后吸取1 mL 菌液用于菌落计数，其余菌液全部转接于10 mL 具塞试管中，加入新鲜巴氏改良液体培养基，34 ℃密封、避光培养5～7 d。诱变后菌种需进行3～4 次继代培养，培养结束后待用。

1.2.2.1.4 诱变后菌种分离

平板倾注法：在无菌条件下吸取1 mL 1.2.2.1.3中的待用菌液，进行梯度稀释，选择10～10梯度进行平板转接。将提前高压灭菌的己酸菌富集培养基倾注于平皿中，充分摇匀。凝固后倒置于厌氧培养盒中，34 ℃密封避光培养4～5 d。

挑取单菌落：选择形态独立的菌落进行挑取，转接入5 mL 具塞试管中，加入巴氏改良培养基，34 ℃密封避光培养7 d。

1.2.2.1.5 代谢产物检测

样品处理：吸取1 mL己酸菌液，加入0.1 mL 甲酸酸化处理，加入50%的乙醇溶液定容到10 mL，充分振荡40 s，过0.22µm 滤膜后，注入1.5 mL 样品瓶中，上气相色谱检测。色谱条件：色谱柱CP-Wax57 CB（50 m 长，内径0.25 mm，膜厚0.2 mm）；柱温采用程序升温，初始温度为50 ℃，保持2 min，升温速率为15 ℃/min，终止温度为230 ℃，保持15 min；进样器温度为150 ℃，检测器温度为250 ℃；载气（高纯氮）流速为44 mL/min，氢气流速为30 mL/min，空气流速为400 mL/min；进样量为1µL。

1.2.2.2 氯化锂诱变

1.2.2.2.1 出发菌株

以紫外线诱变分离得到的正突变菌株为出发菌株，进行氯化锂诱变。

1.2.2.2.2 诱变方法

诱变菌体为新鲜、健壮且菌体浓度为10个/mL。将该菌以10 倍稀释梯度进行稀释，选择最适稀释梯度分别倾注于氯化锂添加量为0.3 %、0.6 %、0.9%、1.2%、1.5%的巴氏（改良）培养基平板中，培养条件为34 ℃下避光、倒置培养5 d。

1.2.2.2.3 菌种分离

挑取独立形态较好的单菌落，转接于5 mL具塞试管中，培养基使用巴氏改良液体培养基，密封、避光培养5～7 d。逐级扩大培养，同时跟踪检测代谢产物，方法同1.2.2.1.5。

1.2.3 诱变菌种组合及应用

为了增加己酸菌液的复合香气，决定将诱变得到的3株菌种，两两组合后转接于己酸车间800 kg不锈钢罐中，同步培养，7 d检测代谢产物。生产工艺及培养基如前所述，代谢产物检测方法同1.2.2.1.5。

2 结果与分析

2.1 紫外线诱变结果

2.1.1 紫外线诱变致死率计算

通过对诱变前后菌种进行活体平板计数，计算其致死率，确定最适诱变时间。

结合表1 分析，紫外线诱变致死率在其他参数不变的情况下，随着诱变时间的延长，菌种致死率升高。有研究认为，紫外线诱变致死率在70 %～80 %或者更低时，菌种发生正向突变的几率更大。由表1 可知，诱变时间为2 min 时，致死率为71.13%，在最适致死率范围之内。诱变时间为4 min和6 min时的致死率超出最适致死率范围。故紫外线最适诱变时间确定为2 min。

表1 诱变后活体致死率

2.1.2 诱变后菌种分离结果

对诱变后的菌种进行梯度稀释，选择10～10梯度转接，每梯度吸取1 mL 注入无菌平皿中，加入15～20 mL 己酸菌富集琼脂培养基，充分混匀后，冷却凝固。倒置于厌氧盒中，放入厌氧包及厌氧指示剂，密封，34 ℃培养5～7 d。挑取36 个独立的单菌落分别转接于5 mL 具塞试管中，加入巴氏（改良）液体培养基，密封，避光培养7～10 d。使用1.2.2.1.5方法检测其代谢产物。对照菌株己酸含量为635 mg/100 mL。36 株菌种中，有1 株高于对照，己酸含量为704 mg/100 mL，其余35 株己酸含量均低于100 mg/100 mL。菌种突变率见表2。

表2 分离菌种突变率统计

发生正向突变菌株，菌落小且成圆形，边缘整齐，乳白色。根据其菌落形态命名为XYD1#己酸菌。该菌传代培养5 代后，作为出发菌株进行氯化锂诱变。

2.2 氯化锂诱变结果

选取XYD1# 5 代菌种，菌落平板计数和氯化锂平板复诱变同时进行。氯化锂用量分别为0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%。不同氯化锂浓度致死率见表3。

表3 氯化锂致死率

结合表3分析，随着氯化锂浓度的增加，菌种致死率升高，其中添加量为1.5%时致死率为100%。最适诱变条件为氯化锂添加量0.9%。选择致死率为76.88%的平板进行单菌落分离。共挑取28个单菌落，分别转接于5 mL巴氏改良培养基中密封培养10 d，检测其代谢产物。其中编号为Y18、Y28两株菌种己酸含量高于出发菌株XYD1#，发生正向突变，己酸分别为786 mg/100 mL、803 mg/100 mL；Y11、Y19己酸含量分别为632 mg/100 mL、648 mg/100 mL，接近对照，没有发生突变；其余24 株菌种均低于100 mg/100 mL，发生负突变。菌种突变率见表4。

表4 氯化锂诱变菌种突变率统计

2.3 诱变菌种代谢产物变化规律

对诱变得到的XYD1#、Y18、Y28 3株菌种同步培养，通过连续7 d取样检测其代谢产物，了解每株菌种的代谢产物变化规律。

结合图1 分析，乙酸、丁酸、己酸三大酸在7 d内呈现出此消彼长的趋势。乙酸在培养第2 天时达到最大值，之后一直降低，第5～7 天时基本趋于平稳；丁酸和己酸走势趋于一致，只是增加和降低的幅度较小；己酸在培养前3 d 时产量基本处于平稳状态，从第4天开始己酸翻倍增加，到第7天时己酸达到最大值1127 mg/100 mL。

图1 XYD1#7 d代谢产物变化趋势

结合图2 分析，乙酸、丁酸、己酸三大酸在7 d内仍然是此消彼长的趋势。乙酸在第2 天时达到最大值，之后逐渐降低，第7 天达到最低值。丁酸和己酸走势趋于一致，只是增加和降低的幅度较小；己酸在培养前3 d时产量基本处于平稳状态，从第4 天开始己酸翻倍增加，到第7 天时己酸达到最大值1362 mg/100 mL。

图2 Y18的7d代谢产物变化趋势

结合图3 分析，乙酸、丁酸、己酸三大酸在7 d内仍然是此消彼长的趋势。乙酸在前3 天略有降低，第4～5天时达到最大值，之后逐渐降低，第7天降到最低值。丁酸和乙酸变化趋势一致，只是在第4～6 天时丁酸的增长幅度较大；己酸在培养前3 d时略有降低，从第4天开始己酸翻倍增加，到第7天时己酸达到最大值1286 mg/100 mL。

图3 Y28的7 d代谢产物变化趋势

通过将XYD1#、Y18、Y28 3株诱变菌株同步培养，发现二次诱变得到的Y18、Y28 两株菌种在产己酸方面较XYD1#有所提升，达到了二次诱变的效果。

2.4 诱变菌种组合筛选

3 株诱变菌种两两等比例组合，同步培养7 d，取样检测代谢产物结果见表5，复合香味见表6。

表5 3株诱变菌种两两等比例组合7 d代谢产物(mg/100 mL)

表6 3株菌种组合后复合香气鉴定表

结合表5 分析，组合之后的菌种己酸产量依次是F1＞F3＞F2。而且F1 己酸产量均高于Y28 和XYD1#两株单菌种。说明组合菌种在产己酸方面是相互促进的。各方案己/丁比值仍然是F1＞F3＞F2，说明F1丁酸转化己酸较F2、F3更加彻底。

结合表6 分析，F1、F3 复合香气较F2 浓郁。F1、F2、F3均无异杂味。

结合代谢产物和感官鉴定综合分析，组合之后的菌种无论是己酸产量还是复合香气方面都优于单一菌种，而且组合之后的F1要优于F2、F3。

3 结论

3.1 试验室己酸菌种209#经过复壮后进行紫外线诱变，设计不同试验方案摸索紫外线诱变最佳条件。通过检测菌种致死率，确定209#己酸菌最适诱变条件为：19 W 紫外灯、波长245 nm、照射距离38 cm、照射时间2 min。

3.2 紫外线诱变后菌种采用平板厌氧分离，得到36 株单菌株。通过对其代谢产物检测筛选得到1株正突变菌株，命名为XYD1#。

3.3 利用XYD1#为出发菌株，设计不同浓度的氯化锂添加方案进行二次诱变，诱变后采用平板厌氧分离计数。氯化锂添加量为0.9%的诱变方案致死率为76.92%，为最适诱变方案。分离得到28 株单菌株，通过检测代谢产物，筛选得到两株正突变菌株，命名为Y18和Y28，己酸产量分别为786 mg/100 mL、803 mg/100 mL；两株未突变菌株命名为Y11、Y19，己酸产量为632 mg/100 mL、648 mg/100 mL，与出发菌株XYD1#接近；24 株负突变菌株，己酸产量均低于100 mg/100 mL。

3.4 选取XYD1#、Y18、Y28 3 株正突变菌株进行同步培养，通过逐天跟踪其代谢产物，绘制出3 株菌种的代谢产物变化图。了解各菌株代谢产物变化规律，摸索其生长规律，利于后期培养应用。

3.5 将XYD1#、Y18、Y28 3 株菌种进行两两等比例混合，同时应用到己酸生产车间800 kg 不锈罐中，同步培养7 d。通过分析代谢产物产量及结构，结合香气鉴定，最终确定F1 为最优组合（即Y28∶XYD1#=1∶1），可应用于车间生产，为提高原酒中己酸乙酯含量提供菌种保障。