丁香不同部位挥发油的GC-MS成分分析和抗氧化活性比较

左遨勋，刘积光，高玉梅，刘平怀

（海南大学，海南 海口 570228）

丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.）属桃金娘科植物，是原产于印度尼西亚的一种香料[1]。现已在世界各地广泛种植，主要有印度尼西亚、桑给巴尔和马达加斯加岛[2]。丁香是中国的传统进口“南药”之一，我国从20世纪50年代开始引种，目前在海南、广东、云南等地均有栽培[3]。植物挥发油，也叫植物精油，是一种次生代谢物质，通常从芳香植物中提取[4]。在我国传统中医实践中，医食同源的理念一直贯穿于其中，现在研究表明，丁香花蕾含有挥发油，油中主要含丁香酚、丁香油酸、乙酰丁香油酸及丁香烯、甲基正戊酮、甲基正庚酮、香荚兰醛等成分。

目前国内外对丁香挥发油的研究多集中于丁香花蕾，缺乏对丁香其他部位的挥发油的研究。为了全面开发丁香全植株，本文通过水蒸气蒸馏法提取丁香4个不同部位的挥发油，并通过气相色谱-质谱（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）法鉴定丁香花蕾、丁香果实、丁香叶和丁香枝挥发油的化学成分，并研究丁香4个不同部位挥发油的抗氧化活性，填补了丁香全株挥发油抗氧化活性研究方面的空白，为后续综合利用丁香全植株挥发油提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丁香花蕾：中国广西省药材市场；丁香果实：中国海南省三亚市药材市场；丁香枝、丁香叶：采自海南省兴隆热带植物园，采集的样品为带叶小枝，随后枝叶分离，自然风干。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]、过硫酸钾、三氯乙酸：上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇、三氯化铁：西陇化工股份有限公司；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、铁氰化钾：上海源叶生物科技有限公司；2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪[2，4，6-tris（2-pyridyl）-striazine，TPTZ]：上海阿拉丁生化科技有限公司。以上化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

气相色谱质谱联用仪（Thermo Trace 1300）：美国赛默飞世尔公司；紫外可见分光光度计（TU-1810PC）：北京普析通用仪器有限责任公司；实验室超纯水机（Smart S-15）：上海和泰仪器有限公司；酶标仪（xMark）：BIO-RAD 公司；旋转蒸发仪（RV10plus）：艾卡仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 挥发油的制备

丁香4个部位挥发油采用重挥发油提取装置[5-6]，经水蒸汽蒸馏法提取，料液比为1∶8（g/mL），各部位提取的挥发油具有浓郁的香气，由花蕾部位得到占样品总质量12%的淡黄色透明挥发油，由果实部位得到占样品总质量2%的黄色透明挥发油，由枝部位得到占样品总质量0.9%的黄色透明挥发油，由叶部位得到占样品总质量2.8%的黄色透明挥发油。

1.3.2 化学分析

1.3.2.1 气相色谱条件

气相色谱检测条件：色谱柱Agilent 122-5532UI，DB-5ms Ultra Inert，30 m×250 μm×0.25 μm；进样口温度250 ℃，柱前压 48.27 kPa，进样量 1 μL，载气（He）流量1 mL/min，分流15 mL/min。程序升温：起始温度40℃，保持1min，以40℃/min升温至120℃，以5℃/min升温至240℃，最后以12℃/min升温至300℃，保持6min。

1.3.2.2 质谱条件

质谱检测条件：电子轰击离子源电离方式，电子能量70 eV，接口温度280℃，离子源温度250℃，质量扫描范围m/z 35～350。

1.3.3 体外抗氧化活性的测定

1.3.3.1 DPPH·清除能力测定

根据文献[7]，稍作修改。配制质量浓度为60μmol/L DPPH-乙醇溶液，加入0.5 mL丁香不同部位挥发油，置于阴暗处反应30 min，乙醇调零后在波长517 nm处测量吸光度，阳性对照为VC，DPPH·清除率计算公式如下。

式中：A0为0.5 mL乙醇+4.5 mL DPPH的吸光度；A1为0.5 mL供试品+4.5 mL乙醇的吸光度；A2为0.5 mL供试品+4.5 mL DPPH的吸光度。

1.3.3.2 ABTS+·清除能力测定

参照文献[8-9]，取质量浓度为7 mmol/L的ABTS溶液和质量浓度为2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液，按相同体积混合，避置于阴暗处反应24 h，稀释后使ABTS混合液吸光值为0.700±0.050；取1.9 mL ABTS混合液加入50 μL乙醇稀释的不同浓度的丁香挥发油，置于暗处反应6 min，在波长734 nm处测量吸光度，阳性对照为VC，ABTS+·清除率计算公式如下。

式中：A1为样品组吸光度；A2为对照组吸光度。

1.3.3.3 还原力测定

参照文献[10-11]，取0.5 mL样品，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L PBS溶液（pH6.6）、2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，充分混合。将混合后的溶液放置在50℃水浴锅中反应25 min，再向离心管中加入2.5 mL三氯乙酸溶液，充分混合后离心；吸取上层澄清液体2.5 mL加入2.5 mL蒸馏水、0.5mL 0.1%三氯化铁溶液，摇匀后反应10 min；最后在700nm波长处测定其吸光度，以此表征还原力。

1.3.3.4 铁离子还原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）测定

参照文献[12]，取2.5 mL 20 mmol/L的FeCl3溶液、10 mmol/L TPTZ溶液与300 mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH3.6）按照体积比 1∶1∶10 混合；吸取各浓度混合液于593 nm下测定吸光度A1；加入20 μL稀释到适宜浓度的提取液，反应10 min，测定吸光度A2。计算反应后吸光度减去反应前的吸光度的数值A0，在标准曲线上找到该提取液吸光值A0对应的FeSO4浓度，此浓度即FRAP值。标准曲线回归方程为y=0.000 6x+0.099 8，线性范围 0～3 000 μmol/L（R2=0.999 8）。

1.4 数据处理

运用IBM SPSS Statistics 22.0和Origin 9.64软件进行数据处理，结果表示为平均值±标准差，所有数据均重复试验3次。

2 结果与分析

2.1 挥发油GC-MS分析

表1比较了经GC-MS测定的丁香不同部位挥发油的成分及含量。

表1 丁香不同部位挥发油成分GC-MS分析Table 1 GC-MS analysis of volatile oil of different parts of clove

从丁香花蕾、果实、叶、枝中得到含量为12%、2%、2.8%、0.9%的浅黄色透明挥发油，皆具有浓香味。由表1可知，丁香4个不同部位挥发油共鉴定出43种化学成分，其中倍半萜类为 α-依兰烯、β-石竹烯、（Z，Z，Z）-1，1，4，8-四甲基-4，7，10-环十烯丙烯、葎草烯、β-胡椒烯、β-依兰烯、菖蒲醇、1，2，3，4，4a，7-六氢-1，6-二甲基-4-（1-甲基乙基）萘、反-Z-α-环氧化红没药烯、石竹素、葎草烯环氧化物II、库贝醇、顺-Z-α-环氧化红没药烯、caryophylla-4（12），8（13）-dien-5α-ol、α-蒎 烯、tau.-cadinol、（1R，7S，E）-7-isopropyl-4，10-dimethylenecyclodec-5-enol、异香橙烯环氧化物；炔酯类有 12，15-octadecadiynoic acid，methyl ester、10-heptadecen-8-ynoic acid，methyl ester，（E）-、8，10-十八碳二炔酸甲酯、5，7-十六烯酸甲酯、2，5-十八碳二炔酸甲酯、9，11-十八碳二炔酸甲酯、4，6-十四碳二炔酸甲酯；烯酯类为 4，7，10，13-十六烯酸甲酯、顺-8，11，14，17-二十碳四烯酸甲酯；酚类有4-烯丙基苯酚、丁香酚、2-甲氧基-5-（1-丙烯-1-基）苯酚；醚类为2-烯丙基-1，4-二甲氧基苯、tricyclo[20.8.0.0（7，16）]triacontane，1（22），7（16）-diepoxy-；此外还有少量的酚酯、烯烃、二萜、芳香酮、脂肪酸、醇类等物质。其中丁香酚、β-石竹烯、乙酰丁香酚、2，5-十八碳二炔酸甲酯、9，11-十八碳二炔酸甲酯、司骨化醇、10-heptadecen-8-ynoic acid，methyl ester，（E）-为丁香不同部位挥发油的7个共有成分。

丁香酚、β-石竹烯、乙酰丁香酚作为丁香不同挥发油的共有成分，这3种成分在丁香花蕾中的总比例为94.22%，在丁香果实中的总比例为66.40%，在丁香叶中的总比例为86.30%，在丁香枝中的总比例为56.06%，相对含量均达到50%以上，且在丁香叶中的含量与丁香花蕾中的含量比较接近。但丁香叶和丁香果实的主要成分种类更接近，都含有较高比例的2'，3'，4'-三甲氧基苯乙酮，而丁香花蕾和丁香枝中则没有此成分。丁香枝挥发油检出的成分种类最少，但其中的异柠檬酸乙酯是丁香果实不具有的，正三十七烷醇是丁香叶挥发油不具有的。

2.2 抗氧化活性评价

2.2.1 DPPH·清除能力

图1比较了丁香不同部位挥发油与VC的DPPH·清除能力。

图1 丁香不同部位挥发油与VC的DPPH·清除能力Fig.1 DPPH·scavenging ability of volatile oil of different parts of clove and VC

由图1可知，在一定范围内，DPPH·的清除率与浓度有良好的量效关系。随着丁香挥发油浓度的增加，DPPH·清除率也随之增加。根据拟合曲线，VC、丁香叶、丁香花蕾、丁香果实和丁香枝的DPPH自由基清除能 力的 IC50值分别为 （2.51±0.12）、（21.37±0.32）、（37.35±0.82）、（98.18±0.50）、（28.14±0.46）μg/mL。在0～64.23 μg/mL，丁香枝的DPPH·清除率高于丁香花蕾；在 64.23 μg/mL～700 μg/mL，丁香花蕾的 DPPH·清除率高于丁香枝。丁香叶的DPPH·清除率最高但低于VC，丁香果实的DPPH·清除率最低。

2.2.2 ABTS+·清除活性

丁香不同部位挥发油与VC的ABTS+·清除能力见图2。

图2 丁香不同部位挥发油与VC的ABTS+·清除能力Fig.2 ABTS+·scavenging ability of volatile oil of different parts of clove and VC

由图2可知，ABTS+·清除率随着丁香挥发油浓度的增加而增加。VC、丁香叶、丁香花蕾、丁香果实和丁香枝 ABTS+·清除率的 IC50值分别为 （47.77±0.87）、（117.32±0.63）、（139.48±0.76）、（244.99±1.21）、（141.61±0.84）μg/mL。在较低的浓度下，丁香花蕾和丁香枝ABTS+·清除率接近。整体上，ABTS+·清除率大小顺序依次为VC＞丁香叶＞丁香花蕾＞丁香枝＞丁香果实，说明丁香不同部位挥发油均具有良好的ABTS+·清除活性。

2.2.3 还原力

图3比较了丁香不同部位挥发油与VC的还原力。

图3 丁香不同部位挥发油与VC的还原力Fig.3 Reducing power of volatile oil of different parts of clove and VC

还原力常被用作供电子活性的标准，这是测试酚类化合物抗氧化作用的重要机制[13]。还原力也被用作检测中药材抗氧化活性的重要指标[14-15]。由图3可知，丁香叶、丁香花蕾、丁香果实、丁香枝和VC的还原力都随着浓度的增加而增大，大小顺序依次为VC＞丁香叶＞丁香花蕾≈丁香枝＞丁香果实，表明丁香的这些部位都有较好的还原力。

2.2.4 FRAP值

丁香不同部位挥发油与VC的FRAP值见图4。

图4 丁香不同部位挥发油与VC的FRAP值Fig.4 FRAP values of volatile oil of different parts of clove and VC

研究发现，生物活性化合物的供电子与抗氧化活性有关[16-17]。化合物的还原力可以作为其潜在抗氧化活性的一个重要指标。在有还原剂（如抗氧化剂）存在的情况下，Fe3+/铁氰化物复合物会被还原成亚铁形式的抗氧化剂[18]。图4显示，FRAP值随着浓度的增加而增大。VC的FRAP值最大，其次是丁香叶，而丁香花蕾和丁香枝表现出近似的FRAP值，丁香果实最低。在测量的浓度范围内，FRAP值与质量浓度有良好的量效关系，表明丁香不同部位挥发油具有较强的铁离子还原能力。

3 结论

总的来说，丁香不同部位挥发油含有多种相同的成分，丁香酚、β-石竹烯、乙酰丁香酚3种主要成分的总含量都在50%以上，表明了丁香各部位挥发油均具有较高的研究价值，而丁香枝挥发油成分种类与其他3个部位有较大的差异。

抗氧化试验结果表明，丁香挥发油具有显著的抗氧化活性，这可能与丁香酚和乙酰丁香酚等酚类化合物的含量较高有关。通过与对照组VC的比较可以得出，丁香叶、丁香花蕾、丁香果实和丁香枝的挥发油均具有良好的抗氧化性能。因此，从丁香不同部位中提取的挥发油可以作为一种天然抗氧化剂，在食品、药品的长期储存等方面具有潜在应用价值。