不同亚麻籽胶添加量对大豆分离蛋白成膜性能的影响

胡海玥，石可歆，李海岭，李子来，袁哲，周彩莹，杨晨，3*，汪建明*

（1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；2.山东天骄生物技术有限公司，山东 菏泽 274108；3.优滋福（天津）食品科技有限公司，天津 300457）

随着现代食品工业科学技术的不断更新与发展，可食用膜作为一种具有可降解性能的环保新型食品包装出现在人们的视野中。同时，为了增加其柔韧性并降低脆性，常使用甘油、山梨糖醇等作为增塑剂，降低聚合物分子间的内聚力，增加聚合物链的流动性[1]。将各类可食用的材料应用于食物保鲜方面具有非常悠久的历史，比如将食用蜡涂抹在食品表面用于保鲜，但保鲜效果不佳[2]。

大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）是一种常见的食品添加剂，多数以低温脱溶大豆粕为原料生产，其蛋白质含量在90%以上，蛋白质内部存在氢键、肽键、疏水键、二硫键、离子键等化学结构，具有一定的稳定性，并含有人体必需氨基酸[3-4]。SPI来源广泛，具有良好的成膜能力[5-6]。但是单一的SPI膜存在机械强度不足、功能性较差[7]等缺点，从而导致其应用范围受到限制。Yan等[8]研究SPI与多酚结合物的形成对蛋白质结构和乳化性能的影响，结果表明表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）的加入改变了SPI多肽链的二级结构和三级构象，可见β-链含量减少，α-螺旋和无规则卷曲含量增加。SPI与EGCG以质量比3∶200共价结合后，复合物表现出最佳的溶解性和乳化性能。阳晖[7]通过探究仙草胶对可食性蛋白膜功能特性的影响及作用机理，发现仙草胶和蛋白质分子之间存在着相互作用，如共价交联和分子间氢键作用，添加适量仙草胶会使蛋白膜中无序结构减少，而有序结构增加；而添加过量仙草胶会破坏膜的结构，导致无序结构增加。因此，以SPI为成膜基质，添加其他具有功能性的物质，能够提高膜的物理-机械强度和增加功能性。亚麻籽胶（faxseed gum，FG）是一种绿色安全的食品添加剂，由国家绿色食品发展中心认定[9-10]，在食品工业中，因其具有良好的增稠性、乳化性和乳化稳定性[11]，被广泛用作增稠剂、乳化剂和稳定剂[12-13]。一般来说，在食品配方中添加增稠剂会改变其流变特性，通过增加增稠剂的浓度，不仅会增加流体的剪切黏度，还会增加流体的拉伸黏度[14]。Jiang等[15]利用FG和魔芋葡甘聚糖制备新型复合凝胶的水胶体，研究结果表明，复合凝胶的微观结构变得致密，孔径变小；FG和魔芋葡甘聚糖分子链之间表现出强烈的相互作用和协同效应。

本研究以SPI作为成膜基质，探究不同FG添加量对SPI膜的作用机理，将SPI与FG以不同质量比复配，以甘油为增塑剂制备复合膜，对复合膜的横截面微观结构、二级结构、热稳定性进行分析，并对成膜液的流变特性、粒径进行测定。本研究旨在为今后研究多糖与SPI的作用机制提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPI（98%，食品级）：山东万得福生物科技有限公司；FG（99%，食品级）：浙江一诺生物科技有限公司；甘油（食品级）：天津津东天正精细化学试剂厂；氢氧化钠（分析纯）：天津市津科精细化工研究所；溴化钠（分析纯）：天津市华东试剂厂。

1.2 仪器与设备

HJ-6A恒温磁力搅拌器：上海易友仪器有限公司；GZX-9030MBE电热鼓风干燥箱：上海博旭医疗生物仪器股份有限公司；D-500高剪切分散均质机：德国维根技术（北京）有限公司；FGG1800通风橱：武汉贝科科技股份有限公司；NICOLET IS50傅里叶变换红外光谱仪：德国Thermo Scientific公司；SU1510扫描电子显微镜：日本Hitachi公司；Q50热重分析仪：美国TA Instruments有限公司；Bettersize2600激光粒度分析仪：黑龙江丹东百特仪器有限公司；MARS60动态流变仪：德国HAAKE有限公司。

1.3 FG/SPI成膜液及复合膜的制备

准确称取SPI粉末5 g，溶于100 mL蒸馏水中，磁力搅拌10 min至SPI完全溶解，调节pH值至10，加入2 mL甘油，放入80℃水浴锅搅拌加热30 min，将FG按照 0%、1%、2%、3%、4%、5%的添加量与 SPI充分混合（分别用 FG-0、FG-1、FG-2、FG-3、FG-4、FG-5 表示），继续加热30 min，然后均质5 min，冷却至室温（25℃），静置30 min，获得成膜液，备用。

将70 mL成膜液倒入20 cm×20 cm的亚克力平板上，铺匀，放入通风橱内干燥24 h后取出揭膜。将膜放入装有饱和NaBr溶液的干燥器中，平衡2 d后进行测定。

1.4 成膜液流变特性测定

参考 Murillo-Martínez等[16]的方法，并稍作修改。取一定量的成膜液滴于动态流变仪测试台平行板上，选用CP50锥板，将平行板的间距设定为1 mm，在25℃下进行试验。在静态流变性能测定中，设定模式为控制速率，将剪切速率设置为0.01 s-1～100 s-1。测定动态流变性能时，先对成膜液进行应变扫描，确定成膜液的线性黏弹性区，频率为10 Hz～0.1 Hz。设定模式为控制应变，测定成膜液的储能模量（G′）和损耗模量（G″）。

1.5 成膜液粒径测定

参考Zuo等[17]的方法，用激光粒度分析仪测定分析成膜液的粒径分布。分散相和水的折射率分别为1.570和1.333，测试温度为25℃。在分析前用蒸馏水将样品稀释至1/1 000。

1.6 膜横截面的微观结构观察

应用扫描电子显微镜观察膜的横截断面，将样品用液氮进行淬断，用导电胶将膜垂直固定于载物台上，喷金，将断面放大1 000倍观察。

1.7 膜的红外光谱检测

应用傅里叶变换红外光谱仪采集蛋白膜在4 000 cm-1～400 cm-1的红外吸收光谱，应用衰减全反射附件，分辨率为4 cm-1，扫描次数为32[18]。

1.8 膜的热失重分析

参考雷会宁[19]的方法，应用热重分析仪测定膜的热失重曲线，称取5 mg～8 mg膜样品，以氮气为载气，测定温度为0℃～600℃，升温速率为20℃/min。

1.9 数据统计分析方法

采用SPSS 23.0软件进行方差分析和差异显著性分析。试验所得数据利用Excel进行数据整理，通过Origin 2018软件对试验数据进行绘图。

2 结果与分析

2.1 FG添加量对成膜液静态流变特性的影响

成膜液的流变学行为与其性质和结构有着很强的关联性[7]。如果成膜液的黏度过高，可能会导致成膜时膜内气泡难以消除，但如果黏度过低，成膜时膜的厚度会较薄，导致性能的降低。不同FG添加量对成膜液表观黏度的影响如图1所示。

图1 不同FG添加量对成膜液表观黏度的影响Fig.1 The effect of different FG addition amount on the apparent viscosity of film-forming liquid

所有样品在剪切速率为0.1 s-1～100 s-1时均表现出剪切稀化现象，属于假塑性流体（非牛顿流体）。这种现象主要是由于成膜液内部结构随着剪切速率增加而被破坏，导致黏度降低[20]。由图1可知，与FG-0成膜液相比，FG-1、FG-2和FG-3成膜液的表观黏度略有下降，可能是由于FG-0成膜液表现出了弱凝胶状态[15]，而FG的添加，阻碍了SPI自身的作用，使空间位阻效应发生，导致这种弱凝胶状态被破坏，从而造成成膜液表观黏度的下降[21]。阳晖[7]在仙草胶/SPI成膜液中也发现添加少量的仙草胶会使蛋白质与仙草胶成膜液表观黏度降低，推测是仙草胶会引起蛋白质交联，使有效分子体积增大。在制备成膜液的过程中，添加FG后继续加热30 min，这时，FG和SPI易发生美拉德反应[20]，使蛋白质发生交联，增大其分子的有效体积[22]，也会使成膜液的表观黏度降低。而FG-4和FG-5成膜液的表观黏度与FG-0成膜液相比有了提升，原因可能是过量的FG未能与SPI作用。根据Liu等[14]的研究结果，FG是一种阴离子杂多糖，D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、L-半乳糖、D-半乳糖醛酸和L-鼠李糖是FG的主要成分。FG作为一种水胶体，具有明显的保水能力和流变特性，以及弱凝胶性能，可以与水反应，使更多的水分子被固定，从而导致表观黏度的增加。

2.2 FG添加量对成膜液动态流变特性的影响

动态流变学可以反映各种组分之间的相互作用和结构特征[23]。因此，应用小幅度振荡剪切，研究FG添加量对成膜液动态流变特性的影响。图2为FG添加量对成膜液G′和G″的影响。

图2 不同FG添加量对成膜液G′和G″的影响Fig.2 The effect of different FG addition amount on the G′and G″of film-forming liquid

由图2可知，所有成膜液的储能模量（G′）和损耗模量（G″）均随着频率升高而逐渐增大，因此所有的成膜液都可以被认为是弹性弱凝胶。在0.1 Hz～10 Hz频率范围内，所有成膜液的G′都大于其相应的G″，表示成膜液的不可逆变性程度小于可逆变性程度，即弹性行为大于黏性行为。这种现象可能是由于分子链有足够的时间在低频下解开和重新排列[15]，表明成膜液是黏性流体。因为缠结点在临时交联连接区中发挥作用，所以分子链在高频下解开的时间较短[24]。但是由于在胶体悬浮液中不存在纠缠效应，这意味着FG和SPI具有良好的相容性，这两个组分之间具有紧密的交联网络结构[25]。当FG添加量为1%～3%时，FG中的亲水基团[13]减弱了SPI分子自身之间的相互作用，减少凝集。Guerrero等[26]研究发现，添加少量的多糖会导致蛋白质分子之间的作用被减弱。而FG-4和FG-5成膜液的G′和G″高于FG-0，FG有很强的吸水性，其水溶液具有较高的黏度，该现象可能与过量的未与SPI反应的FG有关，即过量的FG抑制了SPI分子之间的相互作用[27]，影响SPI的凝胶结构，从而增大成膜液的G′和G″值。

2.3 FG添加量对成膜液粒径的影响

动态光散射可以在一定程度上反映FG对成膜液中粒径分布的影响。图3是不同FG添加量对复合膜成膜液粒径的影响。

图3 FG添加量对成膜液粒径的影响Fig.3 The effect of FG addition amount on the particle size of the film-forming liquid

由图3可知，不同成膜液的粒径分布均呈现双峰状态。FG-0成膜液的粒径为14.86 μm，随着FG添加量的增大，成膜液的平均体积也随之发生变化，在添加量为0%～2%时，粒径随FG添加量增加而增大，FG-1粒径为 33.47 μm，FG-2粒径为 55.62 μm，FG-3粒径为58.38 μm。这可能是因为FG与SPI相互作用并聚集[28]，致使粒径增大。当FG添加量大于3%时，成膜液的粒径增加量变大，FG-4的粒径为75.67 μm，FG-5的粒径下降至68.44 μm，这种现象可能是由于大量的FG不能与蛋白质分子交联，从而导致FG自身聚集，使成膜液的粒径增大，从而证明了流变学中当FG添加量大于3%时的成膜液黏度增大这一推测。所有添加FG的成膜液的粒径均大于单一SPI成膜液。

2.4 FG添加量对膜断面微观结构的影响

膜断面的微观结构可以在一定程度上反映膜是否具有均一性和致密性[29]。FG/SPI复合膜横截断面微观结构如图4所示。

图4 FG/SPI复合膜断面扫描电镜图（1 000×）Fig.4 Scanning electron micrograph of cross-section of FG/SPI composite film（1 000×）

由图4可知，所有膜的横截断面均表现出了较为紧密的状态，不同的FG添加量对其膜断面的纹理有一定的影响。FG-3的断面最为平整，其余FG添加量的膜均存在一定程度上呈现鳞片状或条纹的纹理，但均匀致密，没有出现FG与SPI不融合的情况，说明成膜液中的各组分之间相容性较好。单一SPI膜（FG-0）、FG-1和FG-2的横截面有一定的褶皱，原因可能是FG添加量不足，大多数蛋白质分子未与FG发生交联，蛋白质分子之间形成了作用力，出现了聚集的趋势。

FG-3的横截断面平整，无明显纹理或突起，这可能是因为当FG添加量为3%时，减弱了SPI分子之间的相互作用。当FG添加量大于3%时，即FG-4和FG-5的复合膜横截面也出现了褶皱，根据对成膜液流变特性的测定，发现FG-4和FG-5的成膜液黏度较高，导致其成膜比FG添加量为0%～3%的成膜液要困难，不容易形成均一稳定的体系，这个现象与张盼[30]的研究结论相似。也可能是FG之间的作用使其出现了团聚的现象，从而使膜的横截面变得不均匀，影响其宏观性质。

2.5 FG添加量对膜二级结构的影响

采用傅里叶变换红外光谱分析研究FG添加量对膜二级结构的影响，结果见图5。

图5 FG添加量对复合膜二级结构的影响Fig.5 The effect of FG addition amount on the secondary structure of the composite film

所有膜样品在1 031 cm-1～1 039 cm-1处都显示出一个特征性吸收峰，这是在制作膜过程中所添加的甘油的特征峰[17]。所有膜样品在酰胺I带和酰胺Ⅱ带处均显示特征峰。3 270 cm-1～3 273 cm-1主要反映了分子间羟基的伸缩振动变化[31]。2 923 cm-1～2 924 cm-1代表的是-CH2拉伸。添加了FG后，3 273 cm-1处峰位置和强度的细微变化表明了氢键的产生[32]，证明了SPI和FG之间存在氢键的相互作用。1 630 cm-1～1 650 cm-1代表的是C=N伸缩振动峰，这里的形状也发生了细微的改变，而这种改变在FG-2时最大，代表有一定的美拉德反应在FG和SPI之间产生，从而导致结构的改变。由此可得，FG对SPI膜的化学结构有一定的影响。化学结构的变化，可以引起膜宏观性质的改变，在对膜的横截面微观结构进行观察时发现，FG-3的膜横截面相较其他膜而言较为均一致密，也与氢键的产生有关[33]。

2.6 FG添加量对膜热稳定性的影响

测定材料的热失重分解温度可以判断其热稳定性[18]。FG 添加量对复合膜热重（thermal gravimetry，TG）和差热重（differential thermal gravimetry，DTG）曲线的影响如图6所示。

图6 FG添加量对复合膜TG和DTG曲线的影响Fig.6 The effect of FG addition amount on the TG and DTG curves of composite film

由图6可知，所有膜均经历了3个阶段的热损失。25℃至100℃为第一个热降解阶段，这个阶段的质量损失主要是因为膜中的水分蒸发。100℃至250℃为第二个热降解阶段，此阶段主要为增塑剂甘油的蒸发；250℃以上为第三个热降解阶段，此阶段为蛋白质和FG的损失阶段。

热失重分解温度的最高点，可以在一定程度上代表膜的耐高温性能[34]。FG添加量为0%时，即FG-0，其热失重分解温度最高点为285.00℃；随着FG添加量的增大，复合膜的最高热失重分解温度呈现先上升（FG-1为 310.36℃，FG-2为 312.65℃，FG-3为317.84℃）后下降（FG-4为 298.38℃，FG-5为297.87℃）的趋势。但添加了FG的复合膜的耐高温性能均优于单一的SPI膜。当FG添加量为4%和5%时，最高热失重分解温度周围均有与之相近的峰，这可能代表的是未与SPI结合的FG的分解温度峰。

3 结论

本文探究了不同FG添加量（0%～5%）对SPI膜的作用机理，通过对成膜液特性进行探究，发现所有成膜液均属于假塑性流体，弹性行为大于黏性行为，说明FG与SPI具有良好的相容性，具有较为紧密的网络结构，添加了FG的复合膜的热稳定性能均较单一的SPI膜有了提升，最高热失重分解温度从FG-0的285.00℃，提升至FG-3的317.84℃。粒径结果显示，FG与SPI可以产生聚集体。但是当添加量为4%和5%时，未能与SPI分子发生反应的FG阻碍SPI分子之间的相互作用，导致膜的断面重新出现纹理，最高热失重分解温度下降，化学反应减弱。扫描电镜分析表明，所有膜的断面均为紧密的状态，当FG添加量为3%时，复合膜的断面无明显纹理或突起。通过红外光谱分析，FG可以与SPI产生一定的氢键相互作用，从而提升膜的各种性能。本研究探究了FG对SPI成膜液以及复合膜的影响，可为今后深入研究FG对蛋白质成膜特性影响提供一定的参考。