生熟酸枣仁及其皮、仁成分差异性与抗氧化活性研究

肖凤琴 刘 晖 杨亦柳 于 倩 李 佳 张红印 邵 帅 李光哲 严铭铭,2

(1. 长春中医药大学，吉林 长春 130117；2. 吉林省中药保健食品科技创新中心，吉林 长春 130117)

酸枣仁为鼠李科植物酸枣干燥成熟的种子，是卫生部颁布的第一批药食同源药物，富含皂苷、生物碱、黄酮、酚酸、脂肪油以及多糖等多种成分，在改善睡眠、抗焦虑、改善记忆、抗氧化方面具有良好的药理活性，临床上常被用于治疗失眠等中枢神经系统疾病[1-2]。

研究[3-4]表明，酸枣仁中的黄酮类、皂苷类、酚酸类以及脂肪酸类成分具有良好的抗氧化活性。而有关酸枣仁皮部位、仁部位的抗氧化活性研究尚未见报道。课题组前期研究发现，酸枣仁具有良好的抗氧化活性，且酸枣仁皮部位治疗失眠的作用优于仁部位。

研究拟探讨生熟酸枣仁的皮、仁、全枣仁对超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除率及对铁离子的还原能力，并对其成分进行分析，旨在为酸枣仁作为天然抗氧化剂开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

紫外—可见分光光度计：UV-1700型，日本岛津公司；

数显恒温水浴锅：HH-6型，金坛市佳美仪器有限公司；

电子天平：AB135-S型，瑞士Mettler Toledo公司；

电子天平：MS303S型，奥豪斯仪器有限公司；

超声波清洗器：KQ-205B型，昆山市超声仪器有限公司；

低速台式离心机：DT5-2B型，北京时代北利离心机有限公司；

高效液相色谱仪：Agilent1260型，美国Agilent Technologies公司；

粉碎机：MFJ-W300型，北京利仁科技股份有限公司；

多功能酶标仪：Infinite M200pro型，瑞士Tecan公司。

1.2 材料与试剂

酸枣仁：河北仁心药业有限公司；

DPPH：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；

Tris-HCl：分析纯，广州赛国生物科技有限公司；

邻苯三酚：分析纯，天津市光复精细化工研究所；

邻二氮菲、K3Fe(CN)6：分析纯，天津永晟精细化工有限公司；

FeCl3：分析纯，西陇科学股份有限公司；

三氯乙酸：分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；

芦丁标准品、没食子酸标准品：中国药品生物制品检定所；

人参皂苷Re标准品：上海源叶生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备 按2020版《中华人民共和国药典》中的炮制方法对酸枣仁进行炒制[5]，制得熟酸枣仁。将生熟酸枣仁进行剥离，分别得到相应的皮和仁共6种样品：生、熟酸枣仁(全枣仁)，生、熟酸枣仁(仁)，生、熟酸枣皮(皮)。

1.3.2 体外抗氧化活性研究

(1) 样品制备：精密称取生熟酸枣仁的皮部位、仁部位和全枣仁(过四号筛)各2 g，加入70%乙醇20 mL回流提取2 h，提取液转移至50 mL试管中，滤渣用5 mL体积分数为70%乙醇洗涤，合并洗液与滤液，离心，取上清液，并用70%乙醇定容至25 mL。

(1)

式中：

C——自由基清除率，%；

A0——空白对照组吸光度值；

A1——样品组吸光度值；

A2——样品对照组吸光度值。

(3) 羟基自由基(·OH)清除率测定：参照张思颉等[7]的方法并修改。取邻二氮菲溶液1 mL于各试管，加入2 mL PBS溶液，1 mL样品液，混匀后加入1 mL FeSO4溶液，混匀，加入1 mL H2O2溶液，混匀。37 ℃水浴1 h，测定536 nm处吸光度值A1，用蒸馏水调0。以1 mL蒸馏水代替样品液测得A2；以1 mL蒸馏水代替H2O2溶液测得A0。按式(2)计算·OH清除率。

(2)

式中：

C——羟基自由基(·OH)清除率，%；

A0——空白对照组吸光度值；

A1——样品组吸光度值；

A2——样品对照组吸光度值。

(4) DPPH自由基清除率测定：参照张雪娇等[8]的方法并修改。于96孔板中加入样品溶液100 μL，再加入DPPH溶液100 μL，涡旋混匀。暗室反应30 min，测定517 nm处吸光度值A1；以100 μL甲醇代替DPPH溶液作为样品对照组，测定吸光度值A2。按式(1)计算DPPH自由基清除率。

(5) ABTS自由基清除率测定：参照张雪娇等[8]的方法并修改，取0.4 mL ABTS工作液，用pH为7.4的PBS溶液稀释，常温下734 nm处吸光值为(0.7±0.2)。将0.2 mL ABTS工作液与10 μL不同浓度样品混合，常温避光反应6 min，测定734 nm处吸光度，平行3次。按式(3) 测定ABTS自由基清除率。

(3)

式中：

C——ABTS自由基清除率，%；

A1——样品+ABTS溶液吸光度值；

A0——PBS溶液+ABTS溶液的吸光度。

(6) FRAP还原能力测定：取样品液2.5 mL，分别加入PBS溶液2.5 mL，1% K3Fe(CN)6溶液2.5 mL，混匀，50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷却，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混匀，3 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加蒸馏水2.5 mL，0.1% FeCl3溶液0.5 mL，摇匀，静止10 min，测定700 nm处吸光度值A1，以2.5 mL蒸馏水代替样品溶液作为样品对照组，测得A2，以蒸馏水作空白调0，按式(4)计算还原能力大小[9]。

C=A1-A2，

(4)

式中：

C——还原能力；

A1——样品组吸光度值；

A0——样品对照组吸光度。

1.3.3 不同组织部位成分差异性分析

(1) 总黄酮含量测定：取生熟酸枣仁的全枣仁、皮和仁粉末(过四号筛)各2 g，参照2020版《中国药典》中大豆黄卷总黄酮含量测定方法，以芦丁为对照品，以相应试剂为空白。根据芦丁标准曲线，计算样品中总黄酮含量。

(2) 总皂苷含量测定：取生熟酸枣仁的全枣仁、皮和仁粉末(过四号筛)各2 g，参照2020版《中国药典》中人参茎叶总皂苷含量测定方法，以人参皂苷Re为对照品，以相应试剂为空白。根据人参皂苷Re标准曲线，计算样品中总皂苷含量。

(3) 总多糖含量测定：取生熟酸枣仁的全枣仁、皮和仁粉末(过四号筛)各2 g，参照2020版《中国药典》中玉竹总多糖含量测定方法，以无水葡萄糖为对照品，以相应试剂为空白。根据无水葡萄糖标准曲线，计算样品中总多糖含量。

(4) 总酚酸含量测定：取生熟酸枣仁的全枣仁、皮和仁粉末(过四号筛)各2 g，参照2020版《中国药典》中大血藤总酚酸含量测定方法，以没食子酸为对照品，以相应试剂为空白。根据没食子酸标准曲线，计算样品中总酚酸含量。

2 结果与分析

2.1 抗氧化活性

2.1.1 超氧阴离子清除率 超氧阴离子可诱导脂质、蛋白质及DNA的氧化损伤，在活性氧的形成中起重要作用，因此可通过测定抗氧化剂的超氧阴离子清除率来评价其抗氧化能力[10]。由图1可知，生熟酸枣仁不同组织部位均对超氧阴离子具有一定的清除作用，其中生酸枣仁(全枣仁)的清除能力最强；熟酸枣仁(皮)和(仁)的清除能力强于生酸枣仁(皮)和(仁)部位，表明炮制后提高了酸枣仁(皮)和(仁)对超氧阴离子自由基的清除作用。

图1 生熟酸枣仁不同组织部位的超氧阴离子自由基清除率Figure 1 Determination results of superoxide anion clearance in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

2.1.2 羟基自由基清除率 羟基自由基能杀死红细胞，降解DNA、细胞膜和多糖化合物，是毒性最大的氧自由基[11]。由图2可知，生熟酸枣仁不同部位对羟自由基的清除率不同,其中，仁部位对羟基自由基的清除率最弱，皮的最高，其次为全枣仁，且熟制的各样品的清除率高于生品。

图2 生熟酸枣仁不同组织部位的羟基自由基清除率Figure 2 Determination results of hydroxyl radical scavenging rate in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

2.1.3 DPPH自由基清除率 由图3可知，生熟酸枣仁各组织部位对DPPH自由基均具有一定的清除能力，其中皮的清除力高于相应的全枣仁与仁。

图3 生熟酸枣仁不同组织部位的DPPH自由基清除率Figure 3 Determination results of DPPH radical scavenging rate in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

2.1.4 ABTS自由基清除率 由图4可知，酸枣仁各样品对ABTS自由基均具有较好的清除力；其中酸枣仁(皮)对ABTS自由基的清除作用高于全枣仁与仁，且熟酸枣仁的清除率整体高于生酸枣仁。

图4 生熟酸枣仁不同组织部位的ABTS自由基清除率Figure 4 Determination results of ABTS radical scavenging rate in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

2.1.5 FRAP还原能力 还原能力可以用来评价试验样品的抗氧化能力，吸光度值越大，抗氧化剂的抗氧化能力越强[12]。由图5可知，各样品均具有一定的还原能力，其中酸枣仁(皮)的还原能力高于全枣仁与仁，生熟酸枣仁(仁)的还原能力较对应的全枣仁与皮稍弱。

图5 生熟酸枣仁不同组织部位的FRAP还原能力Figure 5 Determination results of FRAP reduction ability in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

综上，酸枣仁各部位对超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基及ABTS自由基的清除能力大小均为皮>全枣仁>仁；且酸枣仁(皮)的还原能力强于对应的全枣仁与仁。因此，酸枣仁各部位的抗氧化能力强弱为皮>全枣仁>仁，酸枣仁炮制前后的抗氧化活性并无明显区别。

2.2 酸枣仁不同组织部位的成分含量

由表1可知，生酸枣仁(皮)中总黄酮含量最高，各样品仁中总黄酮含量整体低于全枣仁与皮；各样品皮中总皂苷、总酚酸含量高于全枣仁与仁；各样品中总多糖含量相近，全枣仁与皮中的多糖含量高于仁；酸枣仁炮制前后各样品中总皂苷、总黄酮、总酚酸以及总多糖含量未发生明显变化。

表1 生熟酸枣仁不同组织部位的成分含量Table 1 Determination results of chemical components in different tissue parts ofraw and ripe ziziphi spinosae semen mg/g

3 结论

试验表明，酸枣仁不同组织部位均具有良好的抗氧化活性，其中酸枣仁(皮)的抗氧化活性强于全枣仁与仁的，且酸枣仁(皮)中总黄酮、总皂苷、总酚酸含量均高于酸枣和仁，可初步推测酸枣仁(皮)中起抗氧化活性作用的药效物质基础为黄酮、皂苷和酚酸类成分；此外，酸枣仁炮制前后抗氧化活性无明显差别。后续可采用不同研究方法对酸枣仁各组织部位进行体内抗氧化活性研究。