海参体腔液提取物对南美白对虾自溶的抑制作用

聂 斌 李傲婷 崔小凡 杜椅楠 阎佳楠 吴海涛,2

(1. 大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2. 国家海洋食品工程技术研究中心，辽宁 大连 116034)

南美白对虾(Penaeusvannamei)是全球最重要的水产养殖三大虾种之一，占全球年产量的近80%[1]，是中国对虾养殖的主要经济种类。2020年，中国南美白对虾产量高达120万t，具有极大的经济价值。但是，由于虾类自身酶系丰富，捕捞后内源酶导致蛋白质降解，严重影响虾类的品质，导致虾类肉质变软甚至自溶[2-3]。据报道，天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶是引起虾肉蛋白质降解的主要因素[4-5]，来自虾头的蛋白酶对虾的肌肉组织有显著的降解作用，并与虾的质地有关[6-8]。为了减缓由虾类自溶引起的质量损失，通常在虾糜制品中加入蛋白酶抑制剂[9]等来抑制其蛋白质的降解。

许多动物体液都具有蛋白酶抑制剂的作用。在牛、猪和鸡的血浆中发现的抑制剂具有蛋白酶抑制活性，可作为抑制原料自溶的基料使用[10-12]，但因疯牛病及宗教和习俗等原因，畜牧蛋白酶抑制剂的应用受到限制。因此，开发利用水生动物蛋白酶抑制剂越来越重要。研究表明，蛋白酶抑制剂广泛存在于水生动物体液中，如斑马鱼和泥鳅[13]、鲤鱼[14]。海参(Stichopusjaponicus)是一种重要的水生生物，具有丰富的营养和滋补价值[15]，其体腔液是海参加工中的主要副产品，占海参总重量的5%～10%。因此，以海参体腔液作为原料，开发食源性天然蛋白酶抑制剂，具有一定的研究价值。

研究拟探究南美白对虾自溶过程中蛋白质降解的适宜条件。并在该基础上，以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、三氯乙酸(TCA)可溶性寡肽释放量为指标研究海参体腔液及其提取物对虾肉自溶中蛋白质降解的抑制作用，以期为海参体腔液的综合开发和利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

新鲜海参(Stichopusjaponicus)和南美白对虾(Penaeusvannamei)：大连当地市场；

所用其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

垂直电泳仪：AE-6450型，日本ATTO公司；

微量台式离心机：Micro 17R型，美国Thermo Scientific公司；

往复式脱色摇床：TS.B-108型，其林贝尔仪器制造有限公司；

凝胶成像仪：MF-ChemiBIS 2.0型，以色列DNR Bio-imaging公司；

真空冷冻干燥机：2KBTES-55型，美国Virtis公司；

酶标定量测定仪：Infinite200 NANO型，瑞士TECAN公司；

精密pH计：PHS-3型，上海雷磁仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理 新鲜南美白对虾去头，去皮，放入匀浆机中充分搅碎，所得虾糜备用。

1.2.2 海参体腔液提取物的制备 根据文献[16]略作修改，取鲜活海参，切头去尾，收集其体腔液，立刻在4 ℃，3 000×g条件下进行离心15 min。取适量离心后的上清液于-80 ℃保存，作为海参体腔液样品备用。其余上清液进一步经磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)于4 ℃下透析(3.5 kDa)处理20 h，透析后样品经冻干，回收冻干粉，作为海参体腔液提取物样本备用。

1.2.3 南美白对虾虾糜自溶的适宜条件

(1) pH的影响：取0.1 g南美白对虾虾糜样品与0.1 mL 磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液进行混合，用磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液调节pH至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0。在50 ℃孵育2 h后，获得南美白对虾虾糜样品。

(2) 温度的影响：根据1.2.3(1)的方法，在pH 3.0的条件下，将孵育温度分别设置为30，40，50，60，70 ℃，孵育2 h，获得南美白对虾虾糜样品。

(3) 时间的影响：根据1.2.3(1)和1.2.3(2)的方法，在pH 3.0和温度50 ℃的条件下，将孵育时间分别设置为1，2，3，4，5，6 h，获得南美白对虾虾糜样品。

1.2.4 海参体腔液及其提取物对虾肉糜自溶的影响 根据文献[17]31所述，将南美白对虾虾糜与一定浓度的海参体腔液及其提取物进行复配，于磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲体系下，在pH 3.0和50 ℃条件下处理样品。针对海参体腔液，添加海参体腔液含量为80%，自溶组条件为水50 ℃孵育2 h，以冰上孵育2 h样品作为对照组。针对海参体腔液提取物，虾靡和体腔液提取物混合样品与缓冲液体系的料液比为1∶5 (g/mL)，海参体腔液提取物添加量分别为3.13，6.25，12.50，25.00 g/100 g虾糜。

1.2.5 SDS-PAGE电泳分析 根据文献[18]所述，待南美白对虾虾糜孵育结束后，按m南美白对虾虾糜∶V上样缓冲液=1∶3 (g/mL) 加入5×上样缓冲液使其反应终止。将样液混合震荡12 h后，取10 μL样品进行上样，采用5%分离胶和10%浓缩胶，在15 mA电流下进行电泳。利用考马斯亮蓝R-250对凝胶进行染色，通过凝胶成像仪拍照成像。

1.2.6 TCA可溶性寡肽含量测定 根据文献[19]略作修改，南美白对虾虾糜孵育结束后，以m南美白对虾虾糜∶VTCA=1∶2 (g/mL)比例添加预冷的20 g/100 mL TCA使其反应终止，待测样液在室温条件下静置20 min后离心15 min，所得上清液采用Folin-酚法进行肽含量的测定。以新鲜虾靡样液为对照，设置数值为1，计算TCA可溶性寡肽相对含量。

1.3 数据处理

所有试验进行3次重复。结果以均数±标准差(SD)表示。采用Student’st软件进行统计分析，P<0.05的水平表示具有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 pH对南美白对虾虾糜自溶过程中蛋白质降解的影响

SDS-PAGE电泳可以按分子量分离蛋白质组分，如图1所示，南美白对虾蛋白质组成较为清晰，在200 kDa左右处可观察到肌球蛋白重链，在44.3 kDa左右处观察到肌动蛋白条带。与对照组新鲜虾糜相比，当pH值为3.0时，肌球蛋白重链和肌动蛋白条带灰度最低，随着pH逐渐升高至8.0时，肌球蛋白重链和肌动蛋白条带灰度逐渐回升，结果表明，当pH为3.0时，对南美白对虾虾糜蛋白的降解程度最显著。因此，确定了南美白对虾虾糜自溶过程中蛋白质降解的适宜pH条件为3.0。

HM. 标准分子量Marker (高) LM. 标准分子量Marker(低) R. 新鲜南美白对虾虾糜图1 pH对南美白对虾虾糜自溶中蛋白质降解的影响Figure 1 The effects of pH on protein degradation in autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

2.2 温度对南美白对虾自溶过程中蛋白质降解的影响

随着孵育温度变化，蛋白质的降解程度也有所不同。如图2所示，当孵育温度由30 ℃逐渐升高时，蛋白质的降解程度逐渐增强，温度达到50 ℃时，蛋白质的降解程度最为显著，表现为肌球蛋白重链和肌动蛋白条带灰度最低，表明南美白对虾虾糜蛋白质降解的适宜温度为50 ℃。当温度超过50 ℃后，随着温度的升高，肌球蛋白重链和肌动蛋白条带灰度逐渐增强，表明蛋白质降解程度逐渐降低。胡玲萍等[20]在探究南极磷虾自溶前后氨基酸和胰蛋白酶降解产物的变化时发现，南极磷虾自溶酶最适温度为55 ℃，与试验结论相类似。Sriket等[21]、Buarque等[22]也得到了较为相似的结果。

HM. 标准分子量Marker (高) LM. 标准分子量Marker(低) R. 新鲜南美白对虾虾糜图2 温度对南美白对虾自溶中蛋白质降解的影响Figure 2 The effects of temperature on protein degradation in autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

2.3 时间对南美白对虾自溶过程中蛋白质降解的影响

如图3所示，在温度为50 ℃、pH值为3.0的条件下，孵育时间越长，南美白对虾虾糜蛋白质的降解程度则越强，当孵育时间超过2 h后，肌球蛋白重链降解程度很强，表现为200 kDa左右处的蛋白条带灰度较低。而44.3 kDa 左右处的肌动蛋白条带随着孵育时间的延长，降解程度与对照组相比有所提高，1～4 h内变化不大。

HM. 标准分子量Marker (高) LM. 标准分子量Marker(低) R. 新鲜南美白对虾虾糜图3 孵育时间对南美白对虾自溶中蛋白质降解的影响Figure 3 The effects of incubation time on protein degradation in autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

综上可知，南美白对虾虾糜自溶中蛋白质降解的适宜条件为pH值为3、孵育温度50 ℃、孵育时间2 h。

2.4 海参体腔液对南美白对虾自溶中蛋白质降解的影响

前期研究[17]19发现，新鲜海参体腔液中粗蛋白质量浓度约为(296.98±1.41) μg/mL，总糖质量浓度约为(71.45±1.23) μg/mL。经透析、冻干处理后得到的海参体腔液提取物中粗蛋白质量分数可达(9.05±0.17) g/100 g。在南美白对虾虾糜中添加新鲜海参体腔液，使体腔液终质量分数达到80 g/100 g，在上述确定的适宜条件下诱导虾糜自溶，进一步通过TCA可溶性寡肽含量的变化，探究海参体腔液对南美白对虾自溶过程中蛋白质降解的影响。

如图4所示，经自溶诱导，虾糜中TCA可溶性寡肽显著释放，与未添加海参体腔液的自溶样品相比，海参体腔液可以显著抑制TCA可溶性寡肽的释放，说明海参体腔液具有抑制南美白对虾虾糜自溶的作用。

不同字母表示有显著性差异(P<0.05)图4 海参体腔液对南美白对虾自溶过程中蛋白质降解的影响Figure 4 The effects of coelomic fluid of sea cucumber on protein degradation during autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

2.5 海参体腔液提取物对南美白对虾自溶中蛋白质降解的影响

在此基础上，进一步将新鲜海参体腔液进行透析、冻干，从而得到海参体腔液提取物，并利用SDS-PAGE分析海参体腔液提取物对南美白对虾自溶中蛋白质降解的影响。

海参体腔液提取物对南美白对虾自溶中蛋白质降解的影响如图5所示，海参体腔液提取物主要抑制虾糜肌动蛋白的降解，表现为44.3 kDa左右处的肌动蛋白条带与自溶组相比灰度较高，且随着海参体腔液提取物添加量增加至6.25 g/100 g虾糜以上，抑制能力有所提高，且添加6.25～25.00 g/100 g虾糜提取物的南美白对虾虾靡自溶作用差别不大。

HM. 标准分子量Marker (高) R. 新鲜南美白对虾虾靡 C. 未添加提取物的南美白对虾自溶样品 1～4. 添加3.13，6.25，12.50，25.00 g/100 g虾糜海参体腔提取物的样品 S. 25.00 g/100 g的海参体腔液的提取物 LM. 标准分子量Marker(低)图5 海参体腔液提取物对南美白对虾自溶过程中蛋白质降解的影响Figure 5 The effects of coelomic fluid isolaton extracts of sea cucumbers on protein degradation during autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

2.6 海参体腔液提取物对南美白对虾自溶过程中TCA可溶性寡肽释放的影响

当海参体腔液提取物添加量为12.50 g/100 g虾糜时，TCA可溶性寡肽释放量被显著抑制(P<0.05)，当海参体腔液提取物添加量为25.00 g/100 g虾糜时，抑制率可达39.0%(见图6)。综上，海参体腔液提取物能有效抑制南美白对虾虾糜自溶中蛋白质的降解程度。

不同字母表示有显著性差异(P<0.05)R. 新鲜南美白对虾样液 C. 未添加提取物的南美白对虾自溶样品图6 海参体腔液提取物对南美白对虾自溶过程中TCA可溶性寡肽释放的影响Figure 6 The effects of coelomic fluid isolaton extracts of sea cucumbers on TCA-soluble oligopeptide release during autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

3 结论

南美白对虾是中国对虾养殖的主要经济种类，为了降低由虾类自溶引起的质量损失，试验在虾糜制品中加入海参体腔液提取物来抑制其蛋白质的降解。南美白对虾虾糜自溶中蛋白质发生显著降解的条件为孵育温度50 ℃、pH值3.0、孵育时间2 h。海参体腔液及其提取物能有效地抑制南美白对虾虾糜蛋白质的降解。