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甲砜霉素与牛血清白蛋白相互作用的热力学研究

2022-04-29赵雪卿王树照

吕梁学院学报 2022年2期
关键词:常数静态白蛋白

赵雪卿,王树照

(吕梁学院 化学化工系,山西 离石 033001)

血清白蛋白(Serum albumin,简称SA)是一种球状蛋白,它在生物体内血浆中占据主导地位,有着非常重要的作用[1].在生物体中,血清白蛋白可以通过运输胆色素、类固醇、氨基酸等物质达到运输的作用,也维持着血液正常的渗透压,在生命过程中有重要的意义[2].BSA具有水溶性,它与人血清白蛋白(HSA)结构同源性和相似的三维结构达到了76%,大多数的有机药物小分子能够和牛血清白蛋白结合,从而运输到靶组织器官中,故被频繁地选择为研究药物与SA相互作用的蛋白质模型[3].甲砜霉素(Thiamphenicol,简称Tap),主要用于治疗由敏感菌引起的呼吸道、肠道等感染.Tap的毒性比氯霉素小,现已成为氯霉素的替代品,但也逐渐被发现其对人体会产生危害[4].本文通过研究不同温度下甲砜霉素与牛血清白蛋白的光谱行为,获得了其相互作用机制、作用力类型以及Tap对BSA构象的影响,这为开发新一代抗菌药物具有重要意义.

1 实验试剂和仪器

牛血清蛋白(BSA,上海金穗生物科技有限公司)5×10-4mol·L-1,用时稀释250倍即2×10-6mol·L-1;甲砜霉素(优级纯,大连科宝生物科技有限公司)2×10-3mol·L-1,用时稀释100倍即为2×10-5mol·L-1;pH为7.40的Tris-HCl缓冲溶液,实验所用水均为二次蒸馏水.

LS-45型荧光分光光度计(美国Perkin Elmer公司),SYC-15B恒温槽(南京肯凡电子科技有限公司),pHS-3C酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司).

2 实验方法

不同温度下,用移液枪准确吸取1.5 mL 2.0×10-6mol·L-1BSA溶液于比色皿中,固定激发波长为278 nm,依次向比色皿中滴加不同体积浓度为2.0×10-5mol·L-1Tap溶液,记录300~450 nm发射光谱.当激发波长范围介于240~320 nm时,分别扫描Δλ=15 nm和Δλ=60 nm的同步荧光光谱.

3 结果与讨论

3.1 荧光光谱

图1~3是不同温度下,随着甲砜霉素浓度的增加,BSA的荧光光谱.由图可知牛血清白蛋白的最大发射波长处于344 nm,随着甲砜霉素的体积逐渐增加,牛血清白蛋白的荧光强度呈现下降趋势,这说明甲砜霉素与BSA发生了相互作用,导致BSA的荧光猝灭.

图1 25℃下甲砜霉素对牛血清白蛋白的猝灭光谱图1.5 mL牛血清白蛋白(2.0×10-6mol·L-1)pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液甲砜霉素(2.0×10-5mol·L-1)的浓度从1到12依次为:(0,0.03,0.98,1.59,2.25,2.56,2.86,3.15,3.43,3.95,4.39,4.94)×10-6mol·L-1

图2 35 ℃下甲砜霉素对牛血清白蛋白的荧光猝灭图谱1.5 mL牛血清白蛋白(2.0×10-6mol·L-1)pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液甲砜霉素(2.0×10-5mol·L-1)的浓度从1到12依次为:(0,0.03,1.07,1.76,2.09,2.40,2.71,3.00,3.29,3.83,4.33,5.07)×10-6mol·L-1

图3 45 ℃下甲砜霉素对牛血清白蛋白的荧光猝灭图谱1.5 mL牛血清白蛋白(2.0×10-6mol·L-1)pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液甲砜霉素(2.0×10-5mol·L-1)的浓度从1到9依次为:(0,0.03,0.20,1.07,1.71,2.25,2.81,3.43,4.08)×10-6mol·L-1

3.2 荧光猝灭类型判断

分子荧光猝灭主要分为动态猝灭和静态猝灭.其中,动态猝灭主要发生在猝灭剂与发光物质的激发态(Si)分子之间的相互作用,静态猝灭则主要发生在猝灭剂与发光物质的基态(S0)分子之间的相互作用[5-8].其中动态猝灭涉及到的是能量转移过程或电子转移过程,所以不会影响到血清白蛋白的构象.静态猝灭则会影响到BSA的构象及其生理活性[9].为了确定甲砜霉素Tap与牛血清白蛋白SA相互作用的猝灭类型,假定其为动态猝灭,可利用Stern-Volmer公式(公式1)计算动态猝灭常数.

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中Kq:双分子猝灭过程的速率常数;τ0:没有加甲砜霉素时测得的牛血清白蛋白的荧光寿命;[Q]为甲砜霉素的平衡浓度;F0为只有BSA溶液时的荧光强度;F为加入Tap溶液时的BSA的荧光强度;KSV叫做S-V猝灭常数.

根据Stern-Volmer方程作图可得:

由图4可得出下表:

图4 不同温度下甲砜霉素与BSA荧光猝灭的Stern-Volmer图

从表1中可以得出,25 ℃下Tap与BSA的猝灭常数为1.44×105L·mol-1,荧光分子的平均寿命τ0约等于10-8s,甲砜霉素对牛血清白蛋白的双分子猝灭常数Kq远大于2×1010L·mol-1·S-1[10],故可以得出Tap对BSA是静态猝灭,改变温度后,Tap对BSA的猝灭方式仍为静态猝灭.在不同温度下比较S-V猝灭常数,可以看出随着温度的升高,其数值在不断的降低.出现该现象可能是由于温度的升高,BSA溶液的黏度降低;另一方面随着温度的升高,溶液中分子,热运动加快,以至于分子的扩散系数增大,从而引起络合物的稳定性降低,导致静态猝灭的程度减小.

表1 S-V方程相关系数

3.3 结合常数KA与结合位点数n的计算

通过表1分析可得出结论,无论在哪个温度下,甲砜霉素与牛血清白蛋白的荧光猝灭类型都是静态猝灭.故可用L-B方程求得甲砜霉素与牛血清白蛋白的结合位点以及结合常数.

L-B方程:

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]

(2)

式中F0:未加甲砜霉素时牛血清白蛋白的荧光强度;F;加入甲砜霉素时的牛血清白蛋白的荧光强度;KA;Tap和BSA的结合常数;n:Tap和BSA的结合位点数.

改变温度条件,通过计算滴加甲砜霉素的浓度,记录滴加不同浓度时的荧光强度,即可通过L-B方程,拟合得图5,求得在25 ℃、35 ℃、45 ℃下的结合位点数n,结合常数KA.方程的斜率为n,截距为lgKA.

图5 不同温度下甲砜霉素与牛血清白蛋白的双对数图

由图5可以得到以下参数:

通过表2可以得出25 ℃、35 ℃、45 ℃的结合位点数分别为1.40、1.23、1.02;结合常数分别为1.41×107L·mol-1、2.09×106L·mol-1、1.78×105L·mol-1.二者的结合常数较大,由此可得出甲砜霉素与牛血清白蛋白之间结合作用较强,可以被蛋白质储存和运输.当温度升高时其结合常数降低,可能是由于随着温度的升高,甲砜霉素与牛血清白蛋白所形成的复合物稳定性降低,使得猝灭常数减小,这与静态猝灭的规律符合.结合位点n也随温度的升高而降低,说明在结合过程中温度的影响非常重要[11].因此,在甲砜霉素和牛血清白蛋白结合过程中,温度是一个很重要的因素.

表2 L-B方程相关参数

3.4 作用力类型的判断

有机药物小分子与蛋白质等大分子之间的作用力主要为范德华力、静电引力、氢键和疏水力等.以上相互作用力也可通过焓变、熵变等的大小和符号来判断.

其中的的ΔH和ΔS可利用范特霍夫方程求得:

(3)

式中KA为25 ℃、35 ℃、45 ℃下的结合常数;R为摩尔气体常数,单位为J/(mol·K).根据计算所得出的焓变ΔH和熵变ΔS,利用吉布斯-亥姆霍兹公式,即可求出Tap与BSA反应的ΔG:

ΔG=ΔH-TΔS

(4)

依据图6中的斜率和截距可求得焓变ΔH和熵变ΔS(焓变和熵变的数值随温度的变化不大,因此可看为定值)再根据式(4)计算出不同温度下的ΔG.具体结果可见表3:

图6 甲砜霉素与牛血清白蛋白相互作用的范特霍夫方程

表3 不同温度下甲砜霉素与BSA相互作用的热力学参数

通过上表,可以发现体系的ΔH<0,ΔS<0,从而判断牛血清白蛋白与甲砜霉素之间的作用力为氢键和范德华力.ΔG<0,说明此反应为自发反应.

3.5 不同温度下甲砜霉素与BSA相互作用的构象分析

同步荧光所测得的Δλ=60 nm与Δλ=15 nm光谱分别表现为Trp和Tyr的特征荧光.其中,在同一浓度下,Trp特征荧光要比Tyr的特征荧光要强.并且它们两个的最大λem与它们所处环境的极性有关.

Δλ=60 nm时,此时表现出色氨酸的特征荧光,Δλ=15 nm时,此时表现出酪氨酸的特征荧光.图7到图12为不同温度下的同步荧图,表明在不同温度下Trp残基的荧光强度逐渐减弱,且最大λem向长波方向移动,发生了红移.说明随着甲砜霉素的不断滴入使得牛血清白蛋白中Trp残基微环境的极性增加,疏水性减弱.在不同温度下Tyr残基的荧光强度都逐渐减弱,最大激发波长向短波方向移动,发生了蓝移.该现象表明随着甲砜霉素的不断滴入使得BSA中Tyr残基微环境的极性减少,疏水性增强.

图7 25 ℃下Δλ=60 nm时Tap对BSA的同步荧光光谱

图8 25 ℃下Δλ=15 nm时Tap对BSA的同步荧光光谱

图9 35 ℃下Δλ=60 nm时Tap对BSA的同步荧光光谱

图10 35 ℃下Δλ=15 nm时Tap对BSA的同步荧光光谱

图11 45 ℃下Δλ=60nm时Tap对BSA的同步荧光光谱

图12 45 ℃下Δλ=15 nm时Tap对BSA的同步荧光光谱

4 结论

不同温度下,甲砜霉素与牛血清白蛋白的作用机制均为静态猝灭,并随着温度的升高,甲砜霉素与牛血清白蛋白的相互作用的结合位点数逐渐降低,结合常数降低,二者结合的作用力为氢键与范德华力,同步荧光表明甲砜霉素对牛血清白蛋白的构像有影响.

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