2016-2019年四川地区HIV-1抗病毒治疗患者治疗效果及耐药性分析*

张 燕,李一平,周 玚,苏 玲,叶 黎,李 玲,杨 洪,梁 姝,袁 丹

四川省疾病预防控制中心,四川成都 610041

越来越多的艾滋病感染者经诊断发现自身的感染状况，并选择接受抗病毒治疗,其治疗比例的提高和药物使用频率的增加使得人类免疫缺陷病毒(HIV)在选择压力下产生突变，对药物敏感的野生毒株逐渐被耐药株取代，使得耐药株成为优势株，造成艾滋病感染者抗病毒治疗效果下降或失败，因此其耐药问题已然成为保证抗病毒治疗效果和提高艾滋病感染者生存质量方面的一个重要挑战[1-4]。通过HIV耐药监测，可及时发现抗病毒治疗患者是否出现耐药，了解全省的耐药情况，指导临床及时调整治疗方案，对治疗失败和产生耐药的原因及时作出科学分析，尽快遏制耐药株的传播和流行。本研究对2016-2019年四川地区接受HIV-1 抗病毒治疗半年以上艾滋病感染者进行耐药监测，以评估艾滋病感染者抗病毒治疗效果及其在四川地区的耐药情况，并为后续抗病毒治疗方案的制订和药物选择提供科学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016-2019年四川地区接受HIV-1抗病毒治疗半年以上且HIV-1载量检测>1 000 cps/mL艾滋病感染者作为研究对象,2016-2019年每年纳入耐药监测的研究对象依次为22 552、41 628、57 745和101 599例，研究对象在接受艾滋病抗病毒治疗前，均进行了知情同意告知。本次调查经四川省疾病预防控制中心伦理委员会审查批准，编号为SCCDCIRB第2021-025号。

1.2仪器与试剂 全自动核酸提取仪MagNA Pure LC 2.0(罗氏公司),QIAxcel毛细管电泳仪(凯杰公司)，Eppendorf 5333-47507型PCR仪，MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit-High Performance 试剂盒(罗氏公司)，accessquick RT-PCR System(A1702)试剂盒(美国Promega公司)，2×Taq PCR MasterMix试剂盒(天根生化公司)。

1.3方法

1.3.1HIV-1 RNA提取 使用罗氏高纯度核酸提取试剂盒，根据标准操作程序提取HIV-1 RNA。

1.3.2PCR扩增HIV-1pol基因区 使用accessquick RT-PCR System(A1702)试剂盒，进行反转录和第1轮扩增，反应体系为25 μL,引物为MAW26和RT21；使用2×Taq PCR MasterMix试剂盒，以第1轮扩增反应产物为模板进行第2轮扩增，反应体系为50 μL,引物为PRO-1和RT20[5]。扩增产物长度为1 200 kb，包含了蛋白酶和逆转录酶区。反应条件参考《HIV耐药监测策略和检测技术》[6]。

1.3.3测序 将PCR产物经毛细管电泳后，1 200 bp处出现条带的扩增产物送北京诺赛公司进行进一步的纯化和一代测序。

1.3.4序列分析 将测得的序列结果用软件Sequencher 5.0编辑和拼接，然后将拼接结果用软件Bioedit进行校正，同时与HIV-1 M 组各亚型及0组、N组参考毒株[7]pol基因序列进行比对，比对好的序列用ALiview软件构建基因进化树，并确定基因亚型，登录美国斯坦福大学耐药数据库(http://hivdb.stanford.edu)，在线分析发生耐药突变的位点和突变类型。

1.3.5数据分析 利用WPS 2020建立数据库，计算病毒学失败率和耐药率，病毒学失败率=HIV-1载量大于1 000 cps/mL的人数/接受HIV-1载量检测的人数×100%；耐药率=耐药人数/HIV-1载量大于1 000 cps/mL的人数。

1.4统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，率的比较采用χ2检验，理论频数<5时，采用Fisher精确检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1病毒学失败率分析 2016-2019年四川地区艾滋病感染者病毒学失败率依次为24.91%(5 617例)、14.02%(5 838例)、11.72%(6 769例)和11.54%(11 725例)，呈连续下降趋势(P<0.05)，其中自贡、泸州、德阳、绵阳、内江、乐山、南充、宜宾、广安、雅安、巴中、凉山地区病毒学失败率呈下降趋势(P<0.05)，但部分市州如资阳、甘孜病毒学失败率呈上升趋势(P<0.05)。见表1。

表1 2016-2019年四川地区艾滋病感染者病毒学失败率比较

2.2耐药率分析 对2016-2019年艾滋病感染者中病毒学失败的样本进行耐药检测，成功获得序列分别为4 602、4 514、5 731和9 313例，2016-2019年艾滋病感染者病毒学失败的样本中每年依次有1 612例(28.7%)、1 634例(27.99%)、2 451例(36.21%)和3 896例(33.23%)出现不同程度耐药，其中每年依次有1 531例(94.98%)、1 542例(94.37%)、2 086例(85.11%)和3 707例(95.15%)对非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)耐药，814例(50.5%)、900例(55.08%)、1 657例(67.61%)和1 786例(45.84%)对核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)耐药，92例(5.71%)、95例(5.81%)、117例(4.77%)和196例(5.03%)对蛋白酶抑制剂(PIs)耐药。2016-2019年自贡、内江、凉山及四川地区的耐药率呈上升趋势(P<0.05)。见表2。

表2 2016-2019年四川地区艾滋病感染者耐药率比较(%)

续表2 2016-2019年四川地区艾滋病感染者耐药率比较(%)

2.3各个亚型中突变位点分析 2016-2019年四川地区病毒学失败的艾滋病感染者中发生耐药的样本主要亚型有CRF07_BC、CRF01_AE、CRF08_BC和CRF85_BC亚型。2016-2019年CRF07_BC亚型每年依次为917例(56.89%)、888例(54.35%)、1 269例(51.77%)和2 260例(58.01%)；2016-2019年CRF01_AE亚型每年依次为453例(28.1%)、494例(30.23%)、694例(28.31%)和862例(22.13%)；2016-2019年CRF08_BC亚型每年依次为108例(6.7%)、128例(7.83%)、251例(10.24%)和328例(8.42%)；2016-2019年CRF85_BC亚型每年依次为34例(2.11%)、43例(2.63%)、107例(4.37%)和228例(5.85%)。从表3可以看出各亚型对NRTIs发生耐药性突变的主要位点均为M184V/I和K65R/E，对NNRTIs发生耐药性突变的主要位点为K103N/S，该位点耐药突变率呈现逐年升高趋势。对PIs发生耐药性突变的主要位点为Q58E，其中D67N、K65R/E、K70R/E、G190A位点在CRF01_AE亚型中发生耐药突变频率高于其他亚型，V179D/E位点在CRF85_BC亚型中耐药突变率较高。2017年Q58E位点在CRF85_BC亚型中耐药突变率高于其他亚型(P<0.05)，其余3年均在CRF07_BC亚型中突变率较高。2016年M184V/I位点在CRF85_BC亚型中耐药突变率高于其他亚型，之后连续3年均在CRF07_BC亚型中突变率较高。2016年和2018年K103N/S位点在CRF01_AE亚型中耐药突变率高，2017年和2019年在CRF85_BC亚型中耐药突变率较高。2016、2018、2019年V106M/V在CRF85_BC亚型中耐药突变率较高。2016-2018年连续3年Y181C位点在CRF85_BC亚型中耐药突变率较高，2019年在CRF01_AE亚型中发生耐药突变频率较高。

表3 2016-2019年四川地区艾滋病感染者不同亚型毒株的耐药突变情况[n(%)]

续表3 2016-2019年四川地区艾滋病感染者不同亚型毒株的耐药突变情况[n(%)]

3 讨 论

2016-2019年四川地区抗病毒治疗覆盖率也在不断提高，如何在治疗过程中防止耐药发生和耐药株的传播及流行显得尤为重要。本研究结果显示，四川地区病毒学失败率呈连续下降趋势，说明其抗病毒治疗工作总体保持较好水平。但其中泸州、德阳、宜宾、内江、广安、雅安和凉山州病毒学失败率仍高于10%，提示应及时进行耐药监测，分析治疗失败的原因。凉山的病毒学失败率仍然高于大部分市州，但较往年明显下降，反映了凉山州在开展艾滋病防治攻坚工作以来抗病毒治疗工作已取得一定成效，治疗质量明显提高。资阳、甘孜病毒学失败率连续4年呈上升趋势，考虑受扩大检测和扩大治疗的影响，后续应加强宣教，提高质量，进一步规范抗病毒治疗管理工作。2016-2019年成都市病毒学失败率和耐药率均保持较低水平，这也说明成都市抗病毒治疗工作质量较高。成都相较于四川其他市州经济水平高，医务人员流动性低、专业素养好等，这些因素均有利于提高抗病毒治疗工作质量。2016-2019年自贡、内江、凉山地区艾滋病感染者抗病毒的耐药率呈现上升趋势，可能是由于近几年随着扩大抗病毒治疗覆盖面，四川地区HIV-1载量检测力度和检测及时性不断提高，耐药监测范围逐年扩大，耐药率也随之升高。应分析具体耐药情况，尽快更换二线治疗药物，加强督促服药，降低耐药率，在扩大艾滋病感染者抗病毒治疗覆盖面的同时需加强用药督导，保证治疗质量，定期对艾滋病感染者进行CD4+T细胞检测和HIV-1载量检测，对HIV-1载量大于1 000 cps/mL但未发生耐药的艾滋病感染者加以重视，指导和督促其正确用药，防止潜在耐药株的形成。

根据四川地区2016-2019年病毒学失败的艾滋病感染者中发生耐药的情况来看，主要亚型有CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和CRF85_BC亚型，其中CRF01_AE和CRF07_BC亚型的耐药率相对较高，CRF85_BC亚型在耐药中的占比虽然较低，但连续4年呈上升趋势。本研究结果显示，对NRTIs发生耐药性突变的位点在CRF01_AE中发生耐药突变频率高于其他亚型，对NNRTIs和PIs发生耐药性突变的位点在CRF85_BC中耐药突变率较高。耐药突变多以NNRTIs和NRTIs为主，尤其是NNRTIs，突变率达到95%以上，与文献[8-9]研究结果一致，说明近几年四川地区耐药株的亚型构成和药物突变类型没有发生明显变化，各亚型对NRTIs发生耐药性突变的主要位点均为M184V/I和K65R/E，与钟活麟等[10]研究结果相似。对NNRTIs发生耐药性突变的主要位点为K103N/S，与文献[11-13]研究结果一致，该位点在CRF01_AE和CRF85_BC亚型中突变频率较高且呈逐年上升趋势，目前已有科学研究表明，K103N/S位点是接受NNRTI类药物治疗患者中最常见同时也是非常重要的突变，它会对所有NNRTI类药物引起20～30倍的耐药性[14]，应加强监测。多个位点如D67N、K65R/E、K70R/E、G190A在CRF01_AE亚型中发生耐药突变的频率高于其他亚型，M184V/I、Q58E位点在CRF07_BC亚型中突变频率较高，与DONG等[15]研究结果一致，今后应加强对感染CRF01_AE亚型毒株患者的耐药监测和用药督导，减缓耐药发生。V179D/E、V106M/V和Y181C位点在CRF85_BC亚型中耐药突变率较高，其中V179D/E突变会降低NNRTI类药物的敏感性[16],后续工作中应加强对该位点的关注，且CRF85_BC亚型是近年来四川地区新鉴定的重组亚型[17]，从分析结果可以看出该毒株已成为四川地区耐药株的主要亚型之一，耐药突变频率较高，提示该毒株传播速度快，流行范围广，应加强监测，及时进行干预。产生耐药的最主要原因之一是服药依从性差，按时服药能够降低耐药发生的风险，近一半患者是由于不按要求服药等原因导致体内药物不能稳定保持在最适浓度，造成病毒株在药物压力下产生突变，发生耐药。服药依从性是决定抗病毒治疗成功的最关键因素[18]，因此在启动抗病毒治疗前首先要做好依从性教育，加强对患者的服药监督，并定期评估。今后仍需对包括未治疗人群在内的艾滋病感染者加强耐药监测，还可以通过分子传播网络的建立判断耐药株的传播情况，针对性的对重点案例进行调查干预，防止耐药株的进一步传播和扩散。