循环血清外泌体circSATB2相对表达水平对不可切除Ⅲ期NSCLC患者同步放化疗预后的评估价值*

白裕英，青 刚，邓太兵，黄万秀，张 欣，吴 娱

广安市人民医院呼吸与危重症医学科，四川广安 638001

肺癌是世界范围内与癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占所有病例的85%[1]，且部分NSCLC患者在诊断时已不具备手术指征，因此放化疗成为不可切除Ⅲ期NSCLC患者的标准方案。然而由于各种因素的影响，NSCLC患者的治疗结局存在较大差异，因此寻找高效评估患者预后的生物标志物对于指导临床治疗十分重要。外泌体是存在于体液中的一种膜状微囊泡，含有大量脂类、蛋白质、DNA和非编码RNA(ncRNAs)等生物分子，具有细胞间信号传递作用[2]。尤其是一些功能性ncRNAs在癌变发生、进展中扮演着关键角色。近几年，越来越多的环形RNAs分子(circRNAs)被发现，并且因其特殊的结构和重要功能而受到普遍关注[3]。最近ZHANG等[4]通过体外研究证实circRNAs特异AT序列结合蛋白2基因(circSATB2)可能通过靶向结合miR-326，进而激活下游FSCN1信号表达，促使肺癌发展。然而，目前关于circRNAs的临床应用价值仍有待阐明，因此本研究旨在分析循环血清外泌体circSATB2相对表达水平对不可切除Ⅲ期NSCLC患者放化疗预后的早期判断能力。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年3月至2019年10月本院收治的150例不可切除Ⅲ期NSCLC患者(不可切除Ⅲ期NSCLC组)作为研究对象，其中男90例、女60例，年龄25～85岁，平均(51.25±13.66)岁；另选取同期在本院体检健康的志愿者150例为健康对照组[男81例，女69例；年龄18～80岁，平均(51.70±15.14岁)]和临床分期Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者149例作为早期NSCLC组[男87例，女62例；年龄22～80岁，平均(51.11±12.37)岁)]，各组年龄、性别构成比较，差异无统计学意义(P>0.05)。不可切除Ⅲ期NSCLC组完成同步放化疗2周后根据其治疗反应分为缓解组和未缓解组。另外对不可切除Ⅲ期NSCLC组患者进行至少2年随访，根据随访数据分为存活组和死亡组。纳入标准：(1)根据国际肺癌研究协会胸部肿瘤分期手册，经细胞学或穿刺活检病理诊断确定为原发性NSCLC患者，并依据影像学资料按照美国癌症联合委员会第8版的原发肿瘤-区域淋巴结-远处转移分期(TNM分期)系统进行临床分期；(2)纳入的临床分期Ⅲ期NSCLC患者均为不能行手术切除；(3)不可切除Ⅲ期NSCLC组和早期NSCLC组患者入组前6个月未接受过手术、化疗、放疗及生物免疫治疗；(4)年龄≥18周岁，美国东部肿瘤协作组(ECOG)体力状态评分≤2分，估计预期寿命至少为12周；(5)具有完整的病例资料，配合随访。排除标准：(1)合并其他类型肿瘤；(2)有并发疾病或持续/活动性感染的证据；(3)活动性或既往(过去2年内)有自身免疫性疾病或原发性免疫缺陷病史；(3)合并严重的肝肾疾病。所有研究对象都提供了书面知情同意书参与研究。研究程序及修订获当地有关伦理委员会批准，并按照《赫尔辛基宣言》进行。

1.2治疗 治疗前评估包括详细的临床病史资料和一系列生化检查。血液化学检查合格的不可切除Ⅲ期NSCLC组和早期NSCLC组患者接受环磷酰胺为基础的化疗方案，包括紫杉醇、顺铂、卡铂、长春碱、足叶乙甙、培美曲塞等不同组合，并进行同步三维适形放疗(3D-CRT)。研究人员根据修订后的实体瘤疗效评价标准1.1版标准判断治疗反应，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)。NSCLC患者的随访程序包括临床、实验室和成像技术，如X射线计算机断层成像(CT)扫描或正电子发射/CT，这取决于在基线时使用哪种成像方法，不可切除Ⅲ期NSCLC组和早期NSCLC组完成同步放化疗2周后进行治疗反应判断。CR、PR患者为缓解组，SD、PD患者为未缓解组。

1.3方法

1.3.1资料采集 收集不可切除Ⅲ期NSCLC组和早期NSCLC组患者的人口社会学资料(包括年龄、性别、病理类型、分化程度、淋巴结转移状态等)和治疗方案(放化疗方案、治疗周期)。对不可切除Ⅲ期NSCLC患者进行至少2年的随访，记录总生存期(OS)。OS的定义是从开始治疗或初步诊断到死亡或最后随访的日期。

1.3.2循环血清外泌体circSATB2水平检测 治疗前采集3组血样置于含乙二胺四乙酸的试管中。4 ℃下以3 000 r/min离心30 min，收集上清液，保存在-80 ℃。使用InvitrogenTM总外泌体分离试剂(美国Invitrogen公司)，取500 μL血清与外泌体分离试剂混合，混合物在15 000 r/min，4 ℃下离心30 min，然后去除上清液，获得循环血清外泌体沉淀。使用Tecnai G2 Spirit(美国FEI公司)通过透射电子显微镜观察循环血清外泌体的形态和大小。利用NanoSight NS300系统(英国Malvern公司)进行纳米颗粒跟踪分析，检测分离出的循环血清外泌体大小分布。通过蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测TSG101，CD9和CD63外泌体标记膜蛋白。使用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取循环血清外泌体总RNA，取1 μg总RNA加入20 μL混合试剂中进行反转录。然后利用circSATB2特异性引物(上游：AGCCAACCAACTCTTCCGTG，下游：AAAGCACATCTTTC CGCACC)，对循环血清外泌体circSATB2基因进行实时荧光定量PCR扩增，用cel-miR-39用作外部参考，用2-ΔΔCt法分析循环血清外泌体circSATB2相对表达水平。

2 结 果

2.1循环血清外泌体获取及鉴定 用透射电镜观察，显示循环血清外泌体大小为50～150 nm，是一个膜状结构的微小囊泡，符合外泌体的形态特征，见图1A。经Western blot法检测出，循环血清外泌体标志蛋白CD9、CD63和 TSG101呈阳性表达，确定成功分离并纯化外泌体囊泡，见图1B。另外经纳米颗粒追踪技术分析，循环血清外泌体平均粒径为(85.5±4.5)nm，见图1C。

图1 循环血清样本中分离的外泌体特性

2.23组循环血清外泌体circSATB2相对表达水平比较 健康对照组、早期NSCLC组、不可切除Ⅲ期NSCLC组循环血清外泌体circSATB2相对表达水平分别为0.99(0.81，1.21)、1.22(0.94，1.64)和1.62(1.23，2.41)，不可切除Ⅲ期NSCLC组患者循环血清外泌体circSATB2相对表达水平高于健康对照组和早期NSCLC组患者，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3不可切除Ⅲ期NSCLC组循环血清外泌体circSATB2相对表达水平与临床病理特征关系 不可切除Ⅲ期NSCLC组循环血清外泌体circSATB2相对表达水平与原发肿瘤分期(T分期)、化疗周期、有无放射性肺损伤有关(P<0.05)，而与年龄、性别、区域淋巴结分期(N分期)、TNM分期、体力状态评分(ECOG评分)、有无吸烟史、组织分化程度、病理组织类型、查尔森合并症指数(Charlson合并症指数)、有无巩固化疗均无关(P>0.05)。见表1。

表1 循环血清外泌体circSATB2相对表达水平与NSCLC患者临床病理特征的关系

续表1 循环血清外泌体circSATB2相对表达水平与NSCLC患者临床病理特征的关系

2.4循环血清外泌体circSATB2相对表达水平与同步放化疗近期疗效的关系 缓解组和未缓解组循环血清外泌体circSATB2相对表达水平分别为1.42(0.96,2.36)和1.75(1.33,2.41)，未缓解组循环血清外泌体circSATB2相对表达水平高于缓解组，差异有统计学意义(P<0.05)。将不可切除Ⅲ期NSCLC组循环血清外泌体circSATB2相对表达水平分为circSATB2<0.81，0.81≤circSATB2<0.99，0.99≤circSATB2<1.21，circSATB2≥1.21。经单因素和多因素Logistic回归分析，患者循环血清外泌体circSATB2≥1.21时是同步放化疗近期疗效的独立影响因素(P<0.05)。见表2。

表2 单因素和多因素Logistic回归模型分析循环血清外泌体circSATB2相对表达水平与同步放化疗近期疗效的关系

2.5循环血清外泌体circSATB2相对表达水平与NSCLC患者随访2年生存预后的关系 随访2年，存活组和死亡组NSCLC患者循环血清外泌体circSATB2相对表达水平分别为1.33(0.89，1.55)和2.19(1.43，3.39)，死亡组循环血清外泌体circSATB2相对表达水平高于存活组，差异有统计学意义(P<0.05)。循环血清外泌体circSATB2<0.99亚组和循环血清外泌体circSATB2≥0.99亚组各有10例(27.03%)和69例(61.06%)患者死亡。绘制Kaplan-Meier曲线，两个亚组中位总生存时间分别为24个月和15个月，经Log Rankχ2检验，差异有统计学意义(χ2=13.236，P<0.001)。见图2。

图2 随访2年期间病死率Kaplan-Meier曲线

2.6ROC曲线分析circSATB2相对表达水平预测不可切除Ⅲ期NSCLC患者同步放化疗近期疗效和随访2年生存结局的临床价值 循环血清外泌体circSATB2相对表达水平预测不可切除Ⅲ期NSCLC患者同步放化疗近期疗效和随访2年生存结局的AUC分别为0.610(95%CI：0.516～0.704)、0.778(95%CI：0.705～0.850)，对应截断值分别为1.448、1.575，特异度分别为57.6%、70.9%，灵敏度分别为68.1%、70.4%。见图3。

图3 ROC曲线分析

3 讨 论

NSCLC是最常见的肺癌类型[1]，对于不可切除的Ⅲ期NSCLC患者，5年生存率仅为20%[6]。近年来，circRNAs与恶性肿瘤发生机制的关系逐渐被揭示，这为新型生物标志物的发现提供了更多可能[7]。circRNAs是一种的内源性非编码RNA，大量存在于循环血清外泌体中，使其具有更稳定的存在环境[8]。circRNAs可通过稳定的互补结合吸收miRNA，调节基因表达。例如ZHANG等[4]证实circSATB2通过充当miR-326海绵来上调FSCN1表达进而加速NSCLC进程，因此circSATB2在NSCLC组织和细胞中可能具有一定的促癌特性。

外泌体是细胞外膜状微囊泡，其分泌的各种细胞类型直径为40～160 nm。外泌体以选择性的方式从具有不同表型的细胞中主动释放，并且必须转移至受体细胞以抑制其靶mRNA，从而发挥不同的功能[9]。源自宿主细胞的外泌体可能被邻近或远处的细胞吸收，并在这些受体细胞中发挥其生物学作用。循环血清外泌体包含大量生物学分子，如脂质、蛋白、DNA和编码/非编码RNA等[10]。外泌体circRNAs是在所有真核细胞中发现的非编码内源性RNA的新家族。它具有组织特异性和细胞特异性表达模式，可共价封闭内源性生物分子，其生物发生受特定的顺式作用元件和反式作用因子调节[11-12]。与其他非编码RNA相比，circRNAs结构更稳定，因此作为有效的生物标志物的潜力更大[13]。

circRNAs在癌症中的工作机制是多样的，可作为miRNA海绵发挥作用，从而影响miRNA靶基因的表达水平[14]。ZHANG等[4]研究发现，NSCLC细胞中circSATB2相对表达水平显著上调，并可促进NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭。circSATB2有许多miRNA的结合位点，表明circSATB2可能通过miRNA海绵发挥其致癌作用。miR-33a-5p是circSATB2的靶标，并且受circSATB2负调控。据报道，miR-33a-5p作为肿瘤抑制因子与许多癌症的进展有关[15-16]。LIU等[10]发现通过上调miR-33a-5p可缓解circSATB2在雷公藤红素治疗的NSCLC细胞中过表达介导的影响，circSATB2通过下调miR-33a-5p抵消了Cela介导的NSCLC抑制作用，还可通过增强E2F7表达在Cela刺激的NSCLC细胞中起作用。circSATB2通过靶向NSCLC细胞中的miR-33a-5p表达来增强E2F7 mRNA和蛋白质表达。此外CHEN等[17]发现，circSATB2通过结合miR-361-3p和miR-615-5p负调节其在NSCLC中的活性，而circSATB2可以直接与miR-326结合并负调控miR-326表达，从而影响NSCLC的发展。本研究发现，不可切除Ⅲ期NSCLC组循环血清外泌体circSATB2相对表达水平较早期NSCLC组和健康对照组升高，且其与同步放化疗治疗反应和预后结局也有一定关系。同步放化疗近期疗效未缓解组循环血清外泌体circSATB2相对表达水平高于缓解组，随访2年生存预后死亡组circSATB2相对表达水平明显高于存活组，经ROC曲线分析显示循环血清外泌体circSATB2相对表达水平对于预测不可切除Ⅲ期NSCLC患者同步放化疗近期疗效和随访2年生存结局都有较高的AUC，提示循环血清外泌体circSATB2相对表达水平对于预测不可切除Ⅲ期NSCLC患者的预后具有一定的临床应用价值。但本研究仍处于初步探索阶段，仍需要更多的基础和循证医学证据来支持该结论。