类风湿关节炎患者合并巨细胞病毒、EB病毒感染的实验室检测指标研究

彭 武，巫丽娟，魏 彬，陈 捷

四川大学华西医院实验医学科，四川成都 610041

类风湿关节炎(RA)是以慢性、对称性和侵蚀性关节炎为主要临床表现的系统性自身免疫疾病。我国RA患病率为 0.32%～0.36%，可以在任何年龄发病，女性发病率是男性的2～3 倍[1]。如果不及时治疗，会导致软骨退化和侵蚀、全身并发症、身体衰弱甚至死亡[2]。尽管RA发病机制至今尚无定论，但目前主要认为遗传、内分泌、环境、细胞凋亡及感染等因素可通过某些途径影响RA的发生和发展，其中病毒感染被认为是最重要的致病因素[3-5]。研究表明，巨细胞病毒(CMV)和EB病毒等多种病毒感染可能在 RA 发生发展中起着重要的作用[6]，特别是EB病毒被认为是RA最常见的致病因素[7]。另一方面，RA患者的治疗通常需要服用生物制剂(如英夫利昔单抗)、糖皮质激素及慢作用抗风湿药[如甲氨蝶呤(MTX)]等中的一种或多种药物，这些药物在抗类风湿关节炎的同时也降低了机体的免疫功能，易引起CMV、EB病毒等继发感染[8]。此外，CMV和EB病毒还会对RA患者治疗和预后产生影响。在治疗方面，DAVIS等[9]研究发现，CMV持续介导的 T 细胞免疫变化可能会影响早期RA患者对抗风湿药物治疗的临床反应。有研究报道RA患者基线外周血EB病毒DNA载量与利妥昔单抗治疗效果有关，以及EB病毒感染在MTX治疗RA合并相关大B细胞淋巴增生性疾病患者肿瘤发生和消退中起作用[10-11]。DAVIS等[12]研究结果表明，CMV感染的免疫反应可能在RA患者炎症和放射学关节损伤的进展中发挥重要作用。PIERER等[13]研究发现，潜伏的CMV感染会加重RA的临床病程。BROADLEY等[14]观察到CMV感染的RA患者死于心血管疾病的风险增高。SATOU等[15]研究发现，MTX治疗 RA 患者会使包括EB病毒阳性皮肤黏膜溃疡等MTX相关淋巴组织增生性疾病的数量增加。研究者还报道了EB病毒感染的RA患者发生中枢神经系统淋巴瘤、口腔扁平苔藓和EB病毒性肝炎等多种并发症的案例[16-18]。而且，CMV本身就可导致被感染患者从轻微无症状感染到严重缺陷或死亡的各种结局；EB病毒则是传染性单核细胞增多症的病原体，与鼻咽癌、儿童淋巴瘤的发生密切相关，EB病毒是可能致癌的人类肿瘤病毒之一。CMV和EB病毒不仅在 RA发生发展中起作用，还会影响 RA 患者的治疗和预后，所以，对RA患者合并CMV和EB病毒感染的监测及易感因素的研究具有重要价值。本研究旨在研究RA患者合并CMV和EB病毒感染的临床实验室相关检测指标，为临床预测RA患者合并CMV、EB病毒感染及改善这类患者的治疗和预后提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2020年12月在四川大学华西医院就诊的RA患者126例作为研究对象。纳入标准：(1)符合最新的 RA 相关指南或专家共识中的确诊标准[19]；(2)同时检测了CMV-DNA和EB病毒DNA；(3)相关实验室检查资料完整。排除标准：(1)存在其他病毒感染；(2)同时感染细菌或真菌；(3)存在严重基础疾病；(4)合并其他风湿免疫性疾病、艾滋病、器官移植等免疫缺陷或紊乱。本研究经华西医院伦理委员会批准，所有研究对象对本研究内容知情并签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 CMV-DNA检测使用湖南圣湘生物科技股份有限公司的人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，EB病毒DNA检测使用EB病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，均在上海宏石全自动医用PCR分析系统、SLAN®-96P 荧光定量PCR仪上检测。

1.3方法

1.3.1临床相关资料收集 通过医院信息系统收集研究对象基本资料如性别、年龄、治疗等情况，以及 RA 相关实验室指标，如红细胞沉降率、红细胞计数、血红蛋白、血小板计数、白细胞计数、CD3/CD4/CD8T淋巴细胞亚群和绝对计数、CD4/CD8比值、类风湿因子、C-反应蛋白、降钙素原(PCT)、抗链球菌溶血素“O”抗体(抗链“O”抗体)、抗环瓜氨酸(CCP)抗体(抗CCP抗体)、免疫球蛋白、补体及抗核抗体。

1.3.2CMV和EB病毒的实验室检测 (1)检测方法。研究对象抽取外周静脉血至少 2 mL 于含枸橼酸钠抗凝剂的采血管中，立即轻轻颠倒混匀，使用圣湘全血基因组提取试剂处理，得到的 DNA 作为待测样本。取出试剂盒中的各组分，待其温度平衡至室温，混匀后备用。根据待测样本、阴性对照、阳性对照及定量参考品A ～ D的数量，按每人反应液38 μL+酶混合液 2 μL+内标 1.0 μL比例制成 PCR -混合液，瞬时离心后备用。阴性对照、阳性对照、定量参考品A～D分别取10 μL与10 μL核酸释放剂混匀待用。每个PCR反应管中加入上述处理后的待测样本、阴性对照、阳性对照及定量参考品A～D各10 μL，在每管中加入PCR-混合液 40 μL，盖上管盖(去除气泡后)，2 000 r/min 离心 30 s。参照PCR仪使用说明书进行参数设置后进行PCR 扩增。(2)结果判读。质量控制：①阴性对照，无循环阈值(Ct)显示，但内标检测为阳性(Ct≤40)；阳性对照，检测浓度值为(1.35×10-5～1.07×10-6)copy/mL；②4个定量参考品，均检测为阳性且标准曲线相关系数R2≥0.98。以上要求需在同1次实验中同时满足，否则实验无效，需重新进行。参考区间：目标基因的Ct阳性判断值为39，内标的Ct阳性判断值为40(若内标Ct>40或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验)。

2 结 果

2.1基本信息 本研究共纳入RA患者共126例，其中女性95例(75.40%)，男性31例(24.60%)；CMV-DNA阳性的RA患者16例，阳性率12.70%；EB病毒DNA阳性的RA患者12例，阳性率9.52%。CMV-DNA和EB病毒DNA同时阳性的RA患者6例，CMV-DNA和EB病毒DNA均阴性的RA患者104例。

2.2CMV-DNA或EB病毒DNA阳性/阴性RA患者的临床相关指标水平比较 CMV-DNA阳性RA患者的PCT水平[0.12(0.04,0.27)ng/mL]比CMV-DNA阴性RA患者的PCT水平[0.05(0.03,0.08)ng/mL]更高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。EB病毒DNA阳性RA患者各临床相关指标与EB病毒DNA阴性RA患者之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 CMV-DNA阳性RA患者与CMV-DNA阴性RA患者临床相关指标比较

表2 EB病毒DNA阳性RA患者与EB病毒DNA 阴性 RA 患者临床相关指标比较

续表2 EB病毒DNA阳性RA患者与EB病毒DNA 阴性 RA 患者临床相关指标比较

2.3EB病毒DNA和CMV-DNA同时阳性/阴性的RA患者临床相关指标比较 EB病毒DNA和CMV-DNA同时阳性的RA患者IgA水平[4 870.00(3 040.00,5 190.00)]mg/L比二者均阴性的RA患者IgA水平[2 680.00(1 820.00,3 985.00)]mg/L更高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 EB病毒DNA 和CMV-DNA 同时阳性/阴性的 RA 患者临床相关指标比较

续表3 EB病毒DNA 和CMV-DNA 同时阳性/阴性的 RA 患者临床相关指标比较

3 讨 论

CMV、EB病毒影响RA患者的治疗和预后，所以，对RA患者合并CMV和EB病毒感染易感因素的研究具有重要意义。本研究结果显示，CMV-DNA阳性RA患者的PCT水平比CMV-DNA阴性RA患者的PCT水平更高，差异有统计学意义(P<0.05)；EB病毒DNA和CMV-DNA同时阳性的RA患者IgA水平比二者均阴性的RA患者IgA水平更高，差异有统计学意义(P<0.05)。

健康者体内PCT水平极低，血液中几乎检测不到PCT(PCT<0.1 ng/mL)。当机体发生严重细菌、真菌、寄生虫感染，严重休克、脓毒症、全身性炎症反应综合征和多器官功能紊乱综合征时它在血浆中的水平会升高。细菌内毒素在PCT的诱导过程中起到至关重要的作用，所以，PCT可作为一个急性炎症指标来鉴别细菌和非细菌性感染。自身免疫反应、过敏和病毒感染时PCT一般不升高。但一些研究发现， PCT 可在特殊疾病合并病毒感染时升高，如方琪等[20]研究发现，哮喘合并病毒感染组血清 PCT 及 CRP 表达水平高于单纯哮喘组；张正玲等[21]研究结果表明，支气管扩张合并EB病毒感染患者中的 PCT、CRP、IL-6水平显著高于非EB病毒感染的支气管扩张患者;汪俊剑等[22]报道，结缔组织病相关性间质性肺炎患者中EB病毒DNA与PCT呈正相关。虽然目前没有CMV感染导致PCT 水平升高的直接证据，但有研究提到噬血细胞性淋巴组织细胞增生综合征(HLH)患者CMV感染率和PCT水平同时明显高于非HLH的血液肿瘤患者[23]，提示CMV感染可能会影响 PCT 水平。本研究结果显示，CMV感染的RA患者比非CMV感染的RA患者PCT水平更高。这可能是因为CMV感染会加重RA患者炎性反应程度，或病毒感染可促进细菌性感染的发生或增加细菌性感染的风险。本研究结果表明，PCT可作为RA患者感染CMV的预测指标，PCT水平升高可提示临床医生对CMV感染患者及早进行检测和治疗。然而CMV感染引起 RA 患者体内PCT水平升高的具体机制还有待进一步明确。

IgA 是机体免疫细胞被细菌、真菌或病毒等抗原激活后，B细胞分化成熟为浆细胞后所合成的一类免疫球蛋白。分两种类型即血清型IgA和分泌型IgA(SIgA)。血清型 IgA 为单体，免疫作用比较弱。SIgA是机体局部黏膜抗感染免疫的主要抗体，存在于黏膜组织如消化道、呼吸道及泌尿生殖系统。IgA是抑制微生物在黏膜组织附着、减缓病毒繁殖、防止病原体入侵机体的重要免疫屏障[24]。CMV可引起各系统感染，尤其是泌尿生殖系统，从而刺激机体产生CMV-IgA。EB病毒感染可刺激机体产生多种IgA，如Z反式激活因子(Zta)-IgA、早期抗原(EA)-IgA、病毒衣壳抗原(VCA)-IgA和EB病毒核抗原1(EBNA1)-IgA[25-27]。本研究发现，EB病毒DNA阳性RA患者各临床相关指标与EB病毒DNA阴性RA患者之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)；EB病毒DNA和CMV-DNA同时阳性的RA患者IgA水平比二者均阴性的RA患者IgA水平更高，差异有统计学意义(P<0.05)；而有研究也阐述了CMV合并EB病毒感染的传染性单核细胞增多症患者 IgA 水平比 EB 病毒单纯感染的传染性单核细胞增多症患者更高[28]，提示CMV、EB病毒合并感染可能比EB 病毒单独感染刺激机体产生IgA的作用更强。然而本研究病例数较少，结果需扩大样本量进一步验证和谨慎对待。尽管如此，本研究结果还是能在一定程度上表明 IgA 可作为 RA 患者合并 CMV、EB病毒同时感染的潜在依据。

综上所述，本研究通过回顾性分析确诊RA患者合并CMV和EB病毒感染与否的相关临床资料，发现PCT水平升高可提示 RA 患者 CMV感染，IgA升高可能作为 RA 患者合并CMV、EB病毒同时感染的依据。PCT 和 IgA 在 RA 患者诊断CMV 或 EB病毒 感染中具有重要价值，可作为临床上改善 RA 患者治疗效果、预后的重要检测指标。