MALDI-TOF-MS技术在临床分离丝状真菌鉴定中的应用研究*

谢春霞，孙玉娟，马艳辉，赵自云

青岛市中心医院检验科，山东青岛 266042

近年来，随着免疫制剂的不断应用、介入治疗技术的开展及抗菌药物的更新换代，使得临床真菌感染患者越来越多，其致死率明显上升[1]。临床真菌感染主要以丝状真菌和酵母型真菌感染危害最大，其中丝状真菌在某些特定人群中感染率超过酵母型真菌[2]。真菌感染病情严重，进展迅速，不同属种真菌对临床常用一线抗真菌药物敏感性不同，效果有限，因此，及时有效的诊断及感染真菌种属鉴定对于指导临床抗真菌用药治疗意义重大。目前，对于临床微生物的实验室检测主要依靠传统形态学和基因分子生物学，然前者准确率低、耗时长，要求检测人员具有丰富的真菌鉴定经验及专业知识水平，且对于传统形态学较相似的菌株无法准确鉴别；后者鉴定结果精确，但其成本高，对实验室条件及环境要求高，不适合临床常规开展[3]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术是近年新兴的一种微生物鉴定技术，适用于细菌、真菌及病毒的鉴定，准确性高，快速、便捷，近年在细菌、酵母型真菌中的鉴定能力得到肯定[4-5]。因丝状真菌结构复杂，蛋白提取预处理方法尚未形成标准化操作流程等使得MALDI-TOF-MS技术在临床丝状真菌鉴定中的应用相对滞后，相关报道有限。因此本研究结合传统形态学和分子生物学DNA测序，综合对比探究了MALDI-TOF-MS技术在临床分离丝状真菌中的鉴定效果。

1 材料与方法

1.1实验菌株 收集2019年1-12月本院临床标本中分离培养的230株常见丝状真菌，经初步鉴定为丝状真菌菌株，低温保存于菌种保存管。校准菌株为大肠埃希菌ATCC8739，质控菌株为ATCC10106产黄青霉、ATCC16888黑曲霉(购自法国梅里埃生物公司)。

1.2仪器与试剂 MALDI-TOF-MS质谱仪购自法国生物梅里埃公司；ABI600PCR仪购自美国ABI公司；沙氏培养基购自北京智杰方远科技有限公司；凝胶成像系统购自英国Syngene公司；血平板购自美国赛默飞公司；DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；PCR产物测序及真菌引物合成由上海生工公司完成；BASO棉蓝染液购自珠海贝索生物有限公司；甲酸、乙腈购自德国布鲁克公司；Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒、通用引物ITS1和ITS4购自生工Sangon Biotech公司等。

1.3方法

1.3.1真菌分离培养及传统形态学鉴定 将收集菌株接种于沙氏培养基，置于20 ℃培养箱培养2～14 d；待丝状真菌长出菌落后，取清洁载玻片滴加棉蓝染液1滴，透明胶带取少许菌丝贴于载玻片，于显微镜下观察鉴定菌落及菌丝、孢子形态，行传统形态学鉴定丝状真菌菌属。

1.3.2DNA分子生物学检测 根据试剂盒说明书提取真菌DNA，采用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，引物序列ITS1正向：5′-TCCGTACTGAAGCTGCGG-3′，ITS4反向：5′-TCCTCGCGTTATTCATATGC-3′；PCR反应体系：正向、反向引物各1 μL，DNA模板2 μL，2×easy Taq Super Mix 13 μL，ddH2O 8 μL，总体积25 μL；反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循环30次；结束后取5 μL PCR产物用琼脂糖凝胶电泳观察目的片段，测定核酸序列，将测定结果与Genbank数据库序列进行比对鉴定丝状真菌。

1.3.3MALDI-TOF-MS技术鉴定 将收集的丝状真菌菌株点种于沙氏培养基，30 ℃培养24～48 h，在1.5 mL离心管加入无菌水300 μL，挑取10 mg菌体加入混匀，再加入无水乙醇900 μL，均匀，13 000 r/min离心2 min，弃上清，室温静置2 min待菌体完全干燥；加入70%甲酸溶液，吹打混匀沉淀，室温静置2 min，加入乙腈，混匀离心2 min，取上清液1 μL点于靶板，晾干，加入基质溶液1 μL覆盖，晾干，将靶板放入质谱仪进行鉴定。使用MALDI Biotyper3.0系统进行数据库比对，分析鉴定结果。鉴定标准[6]：鉴定得分>1.7分表示准确鉴定到种水平，1.5～1.7分表示鉴定到属水平，<1.5分表示无鉴定结果。每株菌点3个靶点，行平行检测，取得分最高点计入数据统计。

1.4统计学处理 采用SPSS25.0统计软件进行数据分析，检出率、符合率等计数资料采用n(%)表示，行χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1菌株来源及种类分布 研究收集到临床标本分离的丝状真菌230株，包括曲霉菌属183株(79.6%)、青霉菌属23株(10.0%)、镰刀菌属13株(5.7%)、根毛霉3株(1.3%)、石膏样小孢子菌6株(2.6%)、米根霉2株(0.9%)，曲霉菌属以烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉为主。丝状真菌主要来源于痰液及肺泡灌洗液标本共有205株(89.1%)，其次为角膜分泌物和耳道分泌物；痰液中分离最多的是曲霉菌属，其次为青霉菌属；镰刀菌属可见于多种标本，具体菌株来源及种类分布见表1。

表1 230例丝状真菌菌种来源及分布[n(%)]

续表1 230例丝状真菌菌种来源及分布[n(%)]

2.2传统形态学鉴定结果 经传统形态学鉴定菌落形态，综合镜检结果，准确鉴定到种水平的有159株(69.1%)，鉴定到属水平的有71株(30.9%)；传统形态学在烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉等常见曲霉菌中可鉴定到种水平，对于少见曲霉及青霉菌属、镰刀菌属、根毛霉、米根霉等仅鉴定到属水平，见表2。常见丝状真菌菌落形态及镜下形态见图1。

图1 常见丝状真菌菌落形态及镜下形态

2.3DNA测序分析与MALDI-TOF-MS技术鉴定结果 提取培养菌株DNA后行PCR扩增，电泳结果见图2。230株丝状真菌经DNA测序分析鉴定到种水平的准确率为100.0%。MALDI-TOF-MS技术鉴定根据不同菌种特有的质谱峰，结果显示，鉴定到丝状真菌种水平的有204株(88.7%)，主要为曲霉菌属和镰刀菌属；鉴定到属水平的有26株(11.3%)，主要为青霉菌属、根毛霉、米根霉等及其他曲霉属。MALDI-TOF-MS技术鉴定丝状真菌曲霉菌属中烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉及镰刀菌属到种水平的准确率高达100.0%，与DNA测序方法结果符合一致；鉴定青霉菌、根毛霉、米根霉、石膏样小孢子菌仅到属水平，不同鉴定方法结果见表2。

图2 丝状真菌PCR扩增电泳图

表2 230株丝状真菌传统形态学、MALDI-TOF-MS技术、DNA测序鉴定分析比较

续表2 230株丝状真菌传统形态学、MALDI-TOF-MS技术、DNA测序鉴定分析比较

2.4传统形态学、DNA测序与MALDI-TOF-MS技术鉴定结果比较 以DNA测序结果为准，MALDI-TOF-MS技术鉴定到丝状真菌种水平的准确率为88.7%(204/230)显著高于传统形态学鉴定的69.1%(159/230)；鉴定到属水平的准确率为11.3%(26/230)，显著低于传统形态学鉴定的30.9%(71/230)，差异有统计学意义(χ2=26.455，P<0.001)。

3 讨 论

近年来，临床真菌感染病例越来越多，由其引起的病死率也逐渐增高，与抗真菌治疗延迟密切相关。丝状真菌是临床常见且特殊的真菌种类，其种类多，分类复杂，不同种属菌株耐药不同，对一线抗真菌药物反映效果不同[6]。据相关研究报道，由曲霉、镰刀菌等丝状真菌引起的深部感染近年明显增多，抗真菌药物治疗使得耐药病原菌数量、种类明显增加；丝状真菌感染病原菌分布呈现烟曲霉感染比例下降，非烟曲霉和非曲霉丝状真菌感染比例增加的特点，甚至在某些特定人群中感染率超过酵母菌[7-8]。所以，快速准确的鉴定临床真菌种属水平对针对性指导临床用药，降低无效用药率至关重要。

目前，对于丝状真菌的鉴定因其复杂的形态特征及丝状真菌菌株表型特征多变，传统形态学鉴定使得形态学上很难区别的相似菌株鉴定得到准确结果，限制了深部真菌感染的早期诊断及治疗[9]。而基因序列分析技术用于微生物菌株鉴定准确率高，被认为是“金标准”，但其对检测环境及设备、人员要求较高，操作复杂、成本高，不能作为临床鉴定的常规方法。MALDI-TOF-MS技术是近年广泛用于临床微生物病原菌鉴定的新型软电离质谱技术，其通过检测微生物蛋白质指纹图谱，根据不同菌种特有的质谱峰与质谱图数据库中特征性谱图进行比对，进而快速得出微生物鉴定结果，在细菌同源性分析、病原菌分型、毒力因子鉴定及耐药检测等方面表现出优势[10-12]。目前，MALDI-TOF-MS技术在细菌中的鉴定应用相对成熟，在临床微生物的快速鉴定中，近年张霄霄等[13]发现MALDI-TOF-MS技术将酵母样真菌的鉴定率从传统形态学的79.58%提高至95.07%。HANDAL等[14]报道，与16s rDNA相比，MALDI-TOF-MS技术鉴定197株临床分离厌氧菌的准确率达94.9%。SLEIMAN等[15]报道，结合德国布鲁克基质辅助激光解析电离飞行时间质谱丝状真菌数据库和实验室自建18种曲霉谱图，将曲霉种水平鉴定率提高了24%。MCMULLEN等[16]采用VITEK质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定144株曲霉种水平的鉴定率达93.6%，对传统形态学仅鉴定到属水平的曲霉菌株均实现了种水平鉴定。另张伟铮等[17]报道，MALDI-TOF-MS技术对曲霉菌属、毛霉菌属、毛癣菌属及毛孢子菌属等丝状真菌的鉴定率达96.5%～100.0%，对丝状真菌鉴定的总体准确率为86.36%，与内部转录间隔区测序分析符合率为83.97%。张素婷等[18]对临床常见真菌鉴定准确性的Meta分析发现，MALDI-TOF-MS技术鉴定真菌合并灵敏度为97%，合并特异度为85%，受试者工作特征曲线下面积为0.908，其对临床酵母菌属及丝状菌属的鉴定不受菌株来源及仪器等影响，鉴定效果较高。提示MALDI-TOF-MS技术在临床真菌鉴定中的作用日益显著，然其应用缺少实践和经验积累，尤其丝状真菌结构复杂，鉴定过程复杂，现阶段研究报道鲜少，目前仍处于不断探索阶段。本研究从临床共分离出230株丝状真菌，结合传统形态学鉴定和DNA测序分析显示，以DNA测序结果为准，MALDI-TOF-MS技术鉴定丝状真菌到种水平的准确率为88.7%，明显高于传统形态学鉴定的69.1%(χ2=26.455，P<0.001)，发现传统形态学仅对常见曲霉菌属的鉴定率较高，尤对菌落形态及镜下形态相近的菌株鉴定较困难；MALDI-TOF-MS技术对曲霉菌属中烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉和镰刀菌属鉴定到种水平的准确率高达100.0%，与DNA测序方法结果符合一致，而对青霉菌、根毛霉、米根霉等仅鉴定到属水平，低于传统形态学鉴定的属水平，与既往相关报道结果近似，提示MALDI-TOF-MS技术能快速准确的鉴定大多数丝状真菌到种水平，可用于实验室常规鉴定临床真菌的有效补充方法以提高真菌种水平的鉴定，为临床指导用药治疗提供价值参考。

现阶段，MALDI-TOF-MS技术在临床真菌鉴定方面表现出广阔的应用前景，而其鉴定丝状真菌较滞后的原因在于，一是质谱技术主要分析的是胞内核糖体蛋白成分，丝状真菌细胞壁厚且坚韧的特性使得质谱分析不易获得高质量的质谱图谱；同时丝状真菌菌丝和孢子两种细胞成分的质谱峰图存在差异[19-20]。近年，国际上相继开展了大量关于MALDI-TOF-MS技术鉴定丝状真菌最佳实验条件的相关研究，指出MALDI-TOF-MS技术鉴定丝状真菌的最佳培养基为沙氏葡萄糖液体培养基，培养时间为24 h，并指出采用甲酸-乙腈提取法用于质谱分析前处理有助于破坏细胞壁，进一步释放胞内核糖体蛋白，获取高质量质谱峰图[20]。本研究MALDI-TOF-MS技术鉴定丝状真菌条件优化，结果显示，MALDI-TOF-MS技术能有效提高丝状真菌鉴定率，作为传统形态学鉴定的有力补充可应用于临床实验室，是一种快速、高效的鉴定手段。二是数据库的局限性，现有临床常见病原真菌质谱鉴定数据库涵盖范围不够完善，且由于不同地区鉴定效能在同一数据库存在差异，及少数临床真菌缺乏特异性峰值导致其不能鉴定得出[21]。另外MALDI-TOF-MS技术对临床真菌耐药性检测尚未取得突破性进展等均是影响该技术在临床真菌鉴定中广泛应用的主要原因。因此，进一步优化质谱分析前处理，继续更新补充数据库参考菌种数量，提高MALDI-TOF-MS技术鉴定效能，将在临床真菌的快速鉴定中发挥更重要的作用。

综上所述，MALDI-TOF-MS技术鉴定临床丝状真菌符合率高，快速、准确且操作便捷，可作为临床真菌实验室鉴定的有效补充手段，为真菌鉴定提供了新的选择。