黄鳝转铁蛋白基因的克隆及其N-lobe 的重组表达

郑淑婷，臧彧伟，杨龙，李伟

（长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025）

转铁蛋白（Transferrin，Tf）是一种铁离子结合蛋白，典型的Tf 为70～80 kD 的β-球蛋白，包括位于分子N 端和C 端2 个氨基酸序列相似的结构域，每个结构域都能结合一个铁离子[1,2]。Tf 最初在人、鱼类、两栖类和爬行类血清中被发现[3,4]，是运输和代谢铁离子的重要因子，具有调节细胞增殖和免疫系统的作用，参与抗菌杀菌和细胞保护过程[5,6]。Tf的抗菌杀菌机理可能与Tf 的螯合铁特性、遗传多态性和糖基（碳水化合物）三个方面有关[2,7]。20 世纪80年代至今，人们已完成虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）等多种鱼类Tf基因的克隆，证实了鱼类Tf 氨基酸序列的保守性以及运输铁离子功能的稳定性[8,9]。

假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）是遗传多样性丰富的革兰氏阴性杆菌[10]。本研究中所用假单胞杆菌为本实验室从驯养的黄鳝（Monopterus albus）肠道分离出的一种非致病微生物。臧彧伟等[11]克隆了黄鳝肠道假单胞杆菌Bfr 基因，并实现了融合表达，发现添加外源Bfr 蛋白促进了假单胞杆菌的营养生长。鱼类Tf 对嗜水气单胞菌等病原菌的生长有抑制作用[12]，但尚无鱼类Tf 对假单胞杆菌等非致病菌生长影响的相关报道。

黄鳝是一种常见的淡水养殖鱼类，广泛分布于中国、印度等东南亚国家的溪流、池塘和稻田中，具有丰富的营养和药用价值[13]。沈志民等[14]分离纯化了黄鳝血清Tf，分析了其氨基酸组成；王博文等[15]分离纯化了黄鳝血清Tf，得到了黄鳝血清Tf 蛋白，表征分析了其表面形态与二级结构；雷华明等[16]克隆了黄鳝Tf 的C 端基因序列，进行重组表达并制备了其多克隆抗体。但对黄鳝血清转铁蛋白Tf 基因全长及其抑菌能力的研究尚无相关报道。

本研究采用RACE-PCR 技术克隆了黄鳝血清Tf 全长cDNA 序列，并进行了生物信息学分析，构建了该基因N-lobe 的原核表达载体，实现了重组蛋白的诱导表达和分离纯化，探究了黄鳝Tf 蛋白对肠道假单胞杆菌生长的影响，为深入了解黄鳝血清Tf的功能积累基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株

原核表达载体pET28a（Novagen 公司）；大肠杆菌感受态DH5α、BL21（DE3）、pEASY-T1 克隆载体等（北京全式金）；黄鳝肠道假单胞杆菌菌株由长江大学生物医药研究所鉴定并保存。

1.1.2 主要试剂

小鼠抗6His-tag 单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG（Proteintech 公司）；硝酸纤维素膜、DAB 显色试剂盒（武汉谷歌生物）；蛋白质分子量标准、质粒DNA 提取试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒、DNA 聚合酶（北京全式金）；Ni-NTA His·Bind Resin 亲和柱（上海七海生物）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 黄鳝Tf 基因的克隆及序列分析

根据GenBank 数据库人类（Homo sapiens，AAH59367.1）、小鼠（Mus musculus，NP_ 598738.1）和牙鲆（Paralichthys olivaceus，AAF33234.1）等不同物种的Tf 基因序列设计一对基因简并性引物De-Tf-F 和De-Tf-R（表1），以黄鳝肝脏cDNA 为模板，进行PCR 扩增，PCR 产物经凝胶回收试剂盒纯化后克隆至pEASY-T1 载体，选取阳性菌落进行测序验证。将测序结果于NCBI 中比对，获得Tf 保守区序列，再以该段序列作为模板设计特异性外侧引物和内侧引物Tf-GSP5 和Tf-GSP3（表1），进行5’-RACE 和3’-RACE 片段扩增。根据制造商的说明，使用试剂盒进行RACE-PCR 扩增。PCR 产物经凝胶回收试剂盒纯化后，与pEASY-T1 载体连接，转化至DH5α 感受态细胞中，挑取至少3 个阳性克隆进行序列测定验证。将所得cDNA 片段与5’和3’所得cDNA 末端拼接后即得到黄鳝Tf 基因全长cDNA 序列。设计引物Orf-F 与Orf-R（表1）扩增黄鳝Tf 开放阅读框并测定序列。利用NCBI 数据库对测序所得序列进行氨基酸同源性比对，并采用MEGA4.0 软件绘制系统进化树。

表1 本研究中所用到的引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.2 原核表达载体的构建

根据拼接后得到的黄鳝Tf 基因全长cDNA 序列，设计基因特异性引物Rc-tf-F 和Rc-tf-R，以黄鳝肝脏cDNA 为模板扩增黄鳝Tf 基因N 端序列。上下游引物分别添加EcoRⅠ与NotⅠ限制性酶切位点，对扩增产物与pET28a 载体进行EcoRⅠ+NotⅠ双酶切，回收的载体与基因按一定比例进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，对重组质粒进行测序验证，测序正确的重组质粒命名为pET28a/Tf-N。

1.2.3 重组蛋白的诱导表达及纯化

将测序正确的pET28a/Tf-N 重组质粒转化大肠杆菌BL21 感受态细胞，涂布于LB 平板（含50 μg/mL Kana）上，37℃过夜培养。挑取单克隆接种于LB 培养基（含50 μg/mL Kana）中，37℃、220 r/min 振荡培养至菌液OD600约为0.6 时，加入终浓度为0.1 mmol/L 的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），继续37℃、220 r/min 诱导培养4 h。SDS-PAGE 凝胶电泳检测Tf-N 蛋白的表达结果。取200 μL 检测表达的原菌液，加入200 mL LB 培养基中（含50 μg/mL Kana）中，扩大培养至菌液OD600约为0.6 时，加入终浓度为0.1 mmol/L 的IPTG 诱导培养4 h。诱导培养后的菌液4℃、10 000 r/min 离心10 min 收集菌体，加入5 mL PBS 缓冲液（50 mmol/L，pH8.3）重悬菌体。菌体重悬液置于冰上超声波破碎15 min，破碎过程中每破碎5 s，间隔5 s。菌液4℃、10 000 r/min离心10 min，弃上清。沉淀中加入5 mL PBS 缓冲液（50 mmol/L，pH8.3，含6 mol/L 盐酸胍）重悬，置于4℃静置1 h 以上，4℃、10 000 r/min 离心10 min，收集上清。上清用0.45 μm 滤膜过滤后加入Ni-NTA His·Bind Resin 亲和柱结合1 h 以上后，使上清自由流下，加入5 mL PBS 缓冲液（50 mmol/L，pH8.3，含6 mol/L 盐酸胍，100 mmol/L 咪唑）洗脱蛋白。利用SDS-PAGE 凝胶电泳检测Tf-N 蛋白的纯化结果。

1.2.4 重组蛋白的Western blot 检测

将经IPTG 诱导的含pET28a/Tf-N 重组菌的菌液与纯化所得的Tf-N 蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，转移到硝酸纤维素膜上，置于TBST缓冲液（含5%脱脂牛奶）中4℃封闭过夜，取出后用TBST 缓冲液洗膜3 次，每次10 min。随即加入小鼠抗His-tag 单克隆抗体（1∶5 000），37℃孵育2 h，用TBST 洗膜3 次，每次10 min。最后，加入HRP 标记的山羊抗小鼠二抗（1∶10 000）于37℃孵育2 h，TBST 洗涤后用DAB 显色剂显色。以经IPTG 诱导后的含pET28a 空质粒菌株的菌液为阴性对照，以未经IPTG 诱导后的含pET28a/Tf-N 重组菌的菌液为阳性对照。

1.2.5 重组蛋白抑菌活性的检测

挑取假单胞杆菌单克隆于3 mL LB 液体培养基中，30℃、220 r/min 振荡培养6～8 h，使菌液OD600约为0.6。用ddH2O 将活化好的假单胞杆菌稀释至105～106cell/mL 后，取100 μL 稀释的菌液涂布于LB固体培养基上，菌液稍干后放置牛津杯。用含3 mmol/L EDTA 的PBS 缓冲液（50 mmol/L，pH8.3）与不含EDTA 的PBS 缓冲液（50 mmol/L，pH8.3）分别将Tf-N 蛋白稀释至180 μg/L、90 μg/L 和45 μg/L，各取稀释的蛋白200 μL 加入固体培养基上的牛津杯中，随后置于37℃培养过夜，观察、测量抑菌圈直径。用不含EDTA 的PBS 缓冲液（50 mmol/L，pH8.3）将加热灭活的Tf-N 蛋白稀释至180 μg/L、90 μg/L和45 μg/L，取200 μL 加入牛津杯中作为对照，实验重复三次。

1.2.6 重组蛋白对假单胞杆菌铁获取作用的影响

挑取假单胞杆菌单克隆于10 mL 液体LB 培养基中，于30℃、220 μg/L 条件下振荡培养6～8 h，至菌液OD600约为0.6。实验分五组进行，每组取30 μL上述假单胞杆菌菌液加入30 mL LB 液体培养基中，第一组不添加FeCl3与蛋白作为阴性对照；第二组只添加960 μL FeCl3（1 mmol/L）不添加蛋白作为阳性对照；第三组中加入960 μL FeCl3（1 mmol/L）与100 μL Bfr 蛋白（100 μg/mL）；第四组中加入960 μL FeCl3（1 mmol/L）与100 μL Tf-N 蛋白（100 μg/mL）；第五组中加入960 μL FeCl3（1 mmol/L）、100 μL Bfr蛋白（100 μg/mL）与100 μL Tf-N 蛋白（100 μg/mL）。每组菌液补充ddH2O 至35 mL 后，置于30℃、220 μg/L 的条件下振荡培养12 h，从培养3 h 起每隔1 h 取3 mL 菌液保存，每个时点的菌液取三次。用紫外分光光度计测量各时点菌液在600 nm 处的吸光值，以测量的吸光值表征菌液的生物量，实验重复三次。

2 结果与分析

2.1 黄鳝Tf 基因序列

Tf cDNA（GenBank ID：AHA05992.1）全长2 426 bp，5'UTR 与3'UTR 分别为33 bp 与329 bp，含有2 064 bp 的开放阅读框，编码687 个氨基酸的多肽链，包含一个15 bp 的poly（A）尾（图1）。

图1 黄鳝Tf 基因的核苷酸序列及推断的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of swamp eel Tf gene

2.2 Tf 的同源性与系统进化树分析

利用MEGA6.0 和DNAMAN 软件，将黄鳝和其他23 个物种的Tf 氨基酸序列进行比对分析（图2）。系统进化树分析表明，黄鳝Tf 与其他鱼类Tf 聚为一个分支，其中黄鳝与墨西哥脂鲤（Astyanax mexicanus）、青鳉（Oryzias latipes）、真鲷（Pagrosomus major）、大黄鱼（Larimichthys crocea）等辐鳍亚纲物种进化地位较为接近，与两栖动物、哺乳动物、鸟类和昆虫明显亲缘关系较远。

2.3 原核表达载体的构建、表达纯化及鉴定

使用基因特异性引物对Rc-tf-F/R 从黄鳝肝脏cDNA 中扩增获得片段，双酶切后与用同样限制性内切酶双酶切的pET28a 连接，经测序验证的重组质粒转化BL21 感受态细菌，挑取阳性菌株用IPTG进行诱导重组蛋白的表达。SDS-PAGE 电泳结果显示，相对于转空白质粒的菌株与诱导前，诱导后产生了一条分子量约为33 kD 的条带。通过Ni-NTA His Bind Resin 纯化柱结合带有His 标签的蛋白，用100 mmol/L 咪唑洗脱Tf-N 蛋白，SDS-PAGE 电泳检测显示纯化后基本无杂蛋白（图3-A）。将SDS-PAGE 凝胶中蛋白转移至硝酸纤维素膜上，分别用小鼠抗6His-tag 单克隆抗体为一抗和HRP 标记的山羊抗小鼠二抗进行Western blot 免疫印迹显示，带有His 标签的融合蛋白被特异性识别，显示了一条33 kD 的条带，而对照组未产生反应（图3-B），说明已成功实现了重组蛋白Tf-N 的表达及纯化。

图3 重组蛋白Tf-N 的SDS-PAGE 检测（A）与Western blot 分析（B）Fig.3 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）analysis of total protein Tf-N

2.4 Tf-N 蛋白对假单胞杆菌的抑制作用

在涂布假单胞杆菌的LB 固体培养基中加入Tf-N 蛋白，通过观察测量抑菌圈的大小判断Tf-N蛋白对假单胞杆菌的抑制作用。结果显示：与对照组相比，在涂布假单胞杆菌的平板上加入活性Tf-N蛋白会产生抑菌圈，且随着Tf-N 蛋白浓度的增加，抑菌圈大小增加（图4-A）。当加入的Tf-N 蛋白由含3 mmol/L EDTA 的PBS 缓冲溶液稀释时，抑菌圈扩增程度高于加入相同浓度由不含EDTA 的PBS缓冲溶液稀释的Tf-N 蛋白（图4-B）。结果表明，Tf-N 蛋白可以抑制假单胞杆菌的生长，蛋白浓度越高抑制作用越显著，同时EDTA 缓冲液对假单胞杆菌的生长也有抑制作用。

图4 黄鳝重组蛋白Tf-N 抑菌活性检测Fig.4 The antimicrobial activities of recombinant Tf-N on Pseudomonas spp.

2.5 Tf-N 蛋白对假单胞杆菌生长的影响

在假单胞杆菌菌液中外源添加Fe3+、Tf-N 蛋白与Bfr 蛋白，通过吸光值表征法测定假单胞杆菌培养不同时间的生物量，从而判断Tf-N 蛋白对假单胞杆菌生长的影响。结果显示：外源添加Fe3+的情况下，在假单胞杆菌菌液中单独加入100 μL Bfr 蛋白（100 μg/mL）会促进假单胞杆菌的生长；而单独加入100 μL Tf-N 蛋白（100 μg/mL）后，却一定程度上抑制了假单胞杆菌的生长。将Bfr 蛋白（100 μg/mL）与Tf-N 蛋白（100 μg/mL）同时添加100 μL 于假单胞杆菌菌液中时，可促进假单胞杆菌的生长，且其促进作用显著高于仅加入Bfr 蛋白时对假单胞杆菌生长的影响（图5）。

图5 不同时点假单胞杆菌OD600Fig.5 Pseudomonas spp.OD600 values in different time

3 讨论

转铁蛋白（Tf）由N 端和C 端两个结构域组成，并由中间的短链接区连接，两个结构域具有非常高的同源性，每个结构域都能结合一个金属离子[17]。Tf的主要作用是将铁离子安全地运送到身体各处，为生长中的细胞提供所需的铁元素[18]。本实验克隆了黄鳝血清Tf 基因，序列分析表明，黄鳝Tf 基因和其他脊椎动物一样具有N 端和C 端2 个结构域，并与其他鱼类Tf 基因有较高的同源性。在此基础上，笔者利用黄鳝Tf 基因N 端序列构建了表达载体，诱导纯化了33 kD 的重组蛋白Tf-N，为进一步探究黄鳝转铁蛋白抑菌等功能奠定基础。

铁是生物体内含量最丰富的过渡金属，大多数生物体使用铁作为多种代谢酶的重要辅因子，而铁在富氧条件下也会产生毒性，因而精确地维持铁的稳态对于细菌的生存是必要的[19]。对于宿主而言，控制病原菌对自身铁的利用是抵抗病原菌侵染的有效途径之一[20]。本研究结果表明，Tf-N 蛋白可以抑制假单胞杆菌的生长，同时EDTA 对假单胞杆菌的生长也有抑制作用。EDTA 可以和几乎所有的过渡金属离子生成稳定的水溶性螯合物，通过螯合金属离子，破坏细菌维持生存所需的金属环境稳态[21]。本研究证实了只采用黄鳝血清Tf 基因N 端序列重组表达的蛋白仍然具有抑菌作用，推测Tf-N 蛋白的抑菌作用来源于其螯合铁特性，Tf-N 蛋白通过结合铁离子并打破细菌的铁稳态，从而抑制细菌的生长繁殖。

Bfr 是细菌体内重要的储铁蛋白，在铁过量条件下结合Fe3+从而维持细菌细胞质的铁稳态[22]。本研究发现，单独外源性添加Tf-N 蛋白对假单胞杆菌的生长有抑制作用，而将Bfr 蛋白与Tf-N 蛋白等浓度加入假单胞杆菌中时，可促进假单胞杆菌的生长，且其促进作用显著高于仅加入Bfr 时对假单胞杆菌生长的影响。我们推测，在铁过量条件下，宿主利用Tf-N 蛋白铁螯合特性达到抑制细菌生长的目的[11]，而细菌体内特有的Bfr 通过与Tf-N 蛋白相互作用，利用Tf-N 蛋白的铁结合能力，达到结合过量Fe3+维持细菌细胞质铁稳态的目的，从而促进细菌的生长。Tf 和Bfr 的相互作用，以及Tf 的抗菌机理仍需进一步的探索与验证。