抗生素及其抗性基因在水产养殖环境中的污染与消除技术研究进展

张羡宇，马鹏飞，李娜，张莺脐，张倩，刘鹰

（1.大连海洋大学海洋科技与环境学院，辽宁 大连 116023；2.大连海洋大学设施渔业教育部重点实验室，辽宁 大连 116023）

抗生素作为一类抗菌剂被广泛应用于人和动物的细菌性疾病的治疗，在畜牧业和水产养殖业曾作为饲料添加剂以促进养殖生物生长和病害防控。然而，抗生素的吸收利用率较低，70%的抗生素随着机体的代谢排放，最终进入水环境[1]。水环境中抗生素残留会导致细菌产生耐药性，形成抗生素抗性菌（Antibiotic resistance bacteria,ARB）和抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes,ARGs），可能会加速产生超级细菌，严重威胁公共健康安全[2]。此外，环境中“假持久性”残留的抗生素可能会对一些非靶标生物产生毒性作用，长期低浓度抗生素暴露还可能会引起一系列遗传毒性效应[3]。目前，抗生素及抗性基因在水产养殖环境中的污染现象较为普遍，亟待提升对抗生素及抗性基因潜在风险的认识及排放监管力度。综上，本文通过综述了近年来在水产养殖环境中抗生素和抗性基因的污染现状，总结现有消除技术的应用情况及限制性，以期为制定养殖尾水排放标准提供支撑。

1 抗生素和抗性基因在水产养殖环境中的污染现状

1.1 水产养殖环境中抗生素的来源与归趋

中国是世界上最大的水产养殖生产国，占全球供应量的71%，也是全球最大的抗生素生产国和使用国[4]。在畜禽及水产养殖活动中，抗生素常被用于疾病的预防治疗或作为饲料添加剂用于促进养殖生物生长，然而仅有20%～30%的抗生素被吸收利用，其余的抗生素随着食物残渣和粪便排放，最终进入水环境[5]，因此水产和畜禽养殖业被认为是环境中抗生素的主要来源之一。此外，生活及医疗废水中也残留较高水平的抗生素。污水处理厂对水体中有机污染物的处理效率较为有限，含有抗生素的废水会被排放进入近岸海域，或转移进入地下水、地表水，甚至是饮用水中[6]。污水处理厂的出水也被认为是水环境中抗生素的主要来源之一。Zhang等[7]对2013 年中国抗生素的使用及排放的调查结果显示，我国常用的36 种抗生素的总使用量为9.27 万t，约有5.38 万t 被排放到环境中，其中，海河和珠江流域抗生素预测环境浓度值最高，单位面积的排放量每年平均超过79.3 kg/km2。在水产养殖区附近的河流、湖泊、近岸海域及沉积物中均检测到多种抗生素（表1）。

表1 抗生素的检出种类及含量Table 1 Types and contents of the detected antibiotics

抗生素进入水环境后易被吸附并蓄积在沉积物中，较难降解[15]，成为抗生素的“储存库”，养殖区沉积物中的抗生素水平往往高于其在水体中的浓度[16]。残留的抗生素一部分会溶解于水体中，一部分沉积在底泥中，另一部分被水生动物吸收。水产养殖区域附近的水源通常仅经过简单沉淀过滤处理便直接用于养殖生产活动。养殖水环境中残留的抗生素会在养殖生物体内不同组织中富集，引起养殖虾类和鱼类体内抗生素残留超标，使得我国水产品进入欧盟、日本、韩国等国市场受阻，严重影响我国水产品出口贸易，造成严重经济损失。近些年，我国养殖水产品中先后出现了氯霉素、环丙沙星、孔雀石绿和硝基呋喃等抗生素类药物残留事件，养殖水产品的质量安全受到广泛关注[17]。

1.2 水产养殖环境中抗生素残留的生态风险

抗生素随废水排放等途径不断进入养殖水环境，导致其在环境中呈“假持久性”存在，水生生物长时间暴露在受抗生素污染的环境存在较高的生态风险和健康风险。抗生素会在不同营养级的生物体内积累，且部分抗生素沿食物链传递具有生物放大的风险。在莱州湾近岸区域由19 种海洋生物构成的食物网中多种磺胺类抗生素发生了生物放大效应，营养级放大因子为1.4～3.9[18]。抗生素残留还可能会对养殖环境中非标靶生物产生毒性效应，包括藻类、浮游动物及发育早期的养殖生物等。上海市水环境中常被检出的3 种持久性残留抗生素（磺胺甲恶唑、土霉素和氟苯尼考）对小球藻（Chlorella pyrenoidosa）、费氏弧菌（Vibrio fischeri）、大型溞（Daphnia magna）和斑马鱼（Danio rerio）胚胎4 个营养级生物的毒性试验及生态风险评价结果显示，土霉素对4 种模式生物均表现出较高的毒性作用[19]。然而，在实际养殖水环境中不仅存在某单一种类的抗生素，多种抗生素共存可能会对水生生物产生相加，甚至协同的毒性作用。红霉素、恩诺沙星、磺胺甲恶唑三种抗生素两两联合使用对普通小球藻（Chlorella vulgaris）96 h 的急性毒性实验均表现出协同作用[20]。水生态系统中的初级生产者对抗生素敏感性较高，低浓度抗生素持久性存在可能会引起水体中浮游植物的大量生长，包括东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）、球形棕囊藻（Phaeocystis globosa Scherffel）和尖刺拟菱形藻（Pseudonitzschia pungens）等赤潮藻类，可能会对生态环境产生一定的影响[21,22]。抗生素残留也会改变养殖水体中细菌群落结构组成，干扰多种微生物功能，影响水和土壤中微生物氮转化、有机物降解及营养循环，破坏水生态平衡[23]。抗生素残留还会诱导微生物产生抗性基因，甚至诱导产生耐药性极强的超级细菌，在不同养殖环境介质及养殖生物体内传播，极大威胁人类健康。

1.3 水产养殖中抗性基因的产生及污染现状

抗生素残留不断对水环境中的微生物群落造成胁迫压力[24]，直接导致抗性基因的产生和传播。水产养殖中残留的抗生素在水体中和沉积物中不断积累，细菌微生物通过随机染色体突变或水平基因转移获得抗生素抗性基因，导致水产养殖生产环境及其周边区域的微生物耐药性增加[25]。位于可移动遗传元件上的基因片段可通过水平基因转移的方式移动到其他微生物内，使得养殖环境中更多的微生物获得抗性基因片段[26,27]，促进耐药细菌的形成。这使得抗生素的有效作用剂量不断提高，甚至在高出初始使用剂量5 倍的情况下仍无法取得令人满意的治疗效果。已有调查研究显示，水产养殖区的水体和底泥以及养殖动物体内均检测到多种抗性基因，包括养殖中常用抗生素种类的抗性基因，如四环素类抗性基因、磺胺类抗性基因和大环内酯类抗性基因等。水产动物源常见的病原菌如副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、梅氏弧菌（Vibrio metschnikovii）等在水产养殖环境及肠道微生物中常被检测到以质粒的形式携带多种抗性基因（表2）。

表2 水产养殖区抗性基因的污染情况Tab.2 Contamination of antibiotic resistance genes in aquaculture areas

抗性基因的种类和丰度与养殖模式、种类和密度密切相关。在中国水产养殖场中检出的抗性基因种类比国外更丰富。在天津水产养殖场中的检出的抗性基因中，磺胺类抗性基因最为普遍，相对丰度最高（3.0×10-5～3.3×10-4sul1/16S rDNA、2.0×10-4～1.8×10-3sul2/16S rDNA）[45]。在广东省3 个畜禽水产综合养殖场，水和沉积物中均存在多种抗性基因，均检出四环素类（tetA 和tetM）和磺胺类抗性基因（sul1 和sul2）[46]。在大连庄河地区的养殖池塘及网箱养殖区中均检测到磺胺类、四环素类、大环内酯类、喹诺酮类和氯霉素类抗性基因[35]。然而，许多研究表明：在一些未使用过抗生素的水产养殖环境和其他使用过抗生素的畜牧养殖环境中也检测到了抗性基因的存在和传播[47]。在未投加抗生素的工厂化循环水养殖系统中，抗性基因的丰度由养殖动物、粪便、饲料以及处理单元的选择作用共同决定[34]。多项调查研究提示，水产养殖活动造成了多种抗生素和抗性基因的污染，携带抗性基因的抗性菌可通过水平转移的方式在水环境中传播，对全球公共健康和生态安全存在较大的风险。

2 水产养殖环境中抗生素和抗性基因的消除技术

目前，我国水产养殖环境中抗生素及抗性基因检出频繁且种类较多，但并未有专门针对抗生素及抗性基因的监测及相关的管控。许多研究关注污水处理厂中抗生素及抗性基因的去除特性，而对于水产养殖环境中抗生素及抗性基因污染的研究还较少。本文评价了水产养殖中常用的几种消毒方式对抗生素及抗性基因的消除效果。

2.1 氯化消毒技术

氯化消毒通常以游离氯和二氧化氯为消毒剂消除污染物，因其成本较低在全球水处理领域被广泛应用，也是水产养殖源水处理的重要消毒方式[48]。研究表明，游离氯浓度为5 mg/L、10 mg/L 和15 mg/L 时可完全去除城市污水环境中的青霉素、四环素等污染物[49]。氯化消毒主要依赖产生的游离氯，所以pH 是氯化消毒的关键因素，大多抗生素在pH5.5～8.5 之间去除效率较好[50]。抗生素的种类也会影响氯化消毒的效率，阴离子类抗生素比阳离子类抗生素的去除效率更高[51]。然而，氯化消毒可能会产生毒性较强的消毒副产物。喹诺酮氯化后对发光菌的毒性作用增强，四环素氯化后也会生成毒性较强的消毒副产物[52,53]。氯化消毒是水产养殖中最常用的灭菌方法，其成本低、应用广，对细菌的杀灭率高。游离氯直接作用于细菌细胞外膜的蛋白质或肽聚糖，使细胞内大分子泄漏而灭活细菌[54]。游离氯液可作用于细胞质内的目标成分（如DNA、RNA、酶），造成抗性基因片段的裂解[55]。然而，由于实验条件的差异，氯化对尾水中抗性基因的去除作用相差较大。对282 种抗性基因和13 种可移动遗传元件进行氯化消毒处理结果显示，4 mg Cl2/L 的游离氯消毒处理30 min，多种抗性基因和可移动遗传元件均显示出较高的去除率[56]。但也有研究表明，在15 mg Cl2·min/L 条件下对四环素类抗性基因和红霉素类抗性基因无显著去除作用[57]。即使将游离氯浓度提高到300 mg Cl2·min/L，与原始氯浓度相比，抗性基因的含量也没有显著降低[58]。还有报道显示：氯化消毒可能会促进抗性基因的发生[59]。养殖水环境中残留游离氯可能危害养殖生物[60]。因此，水产养殖环境中氯化消毒是否有助于去除抗生素和抗性基因还需更深入的研究。

2.2 紫外线消毒技术

紫外线消毒技术效果好、使用方便、无需额外添加化学物质而被广泛应用于水处理中[61]。抗生素分子吸收光能后变成激发态从引发各种反应，可通过直接光解、间接光解和自敏化光解等方式被去除[62]。大量研究表明：紫外线（UV）辐照可有效地去除水溶液中的抗生素，尤其是对于较难被降解的抗生素去除效果显著[63]。在避光条件下放置50 d，氟苯尼考浓度仅减少2%～7%，在模拟日光照射下氟苯尼考也不会发生光降解反应，而在UV（λ>200 nm）照射下其半衰期仅为（16±3）min[64]。UV 辐照不仅能分解多种抗生素，且在废水处理中不易受到其他有机物的影响[65]。UV 光解实验中显示，UV 可高效降解内酰胺类、氟喹诺酮类和四环素类[63]。较多研究开始关注UV 与催化剂联用对水中污染物的去除。

UV 消除微生物分为直接和间接两种机制，直接机制是UV 可穿透细胞壁、细胞膜和细胞质直接被核酸吸收；间接机制指细胞内外的光敏物质吸收紫外光产生活性氧（ROS）氧化细胞膜、蛋白质、核酸和其他细胞物质而杀灭细菌[66]。理论上UV 消毒是一种去除抗性基因可行的方法。UV 可以高效灭活包括抗性细菌在内的细菌，降低水体中微生物的含量[67]。据报道，经紫外线消毒处理后，废水中的四环素类抗性细菌的数量从103copies/mL 显著减少到102copies/mL[68]。当UV 照射剂量为40 mj/cm2时，四环素类抗性基因去除率为52%～73.5%；当UV 照射剂量达到80 mj/cm2时，可以完全杀灭抗性细菌；当UV 照射剂量升高到160 mj/cm2时，对抗性基因的去除率提高到79.7%～92%[69]。UV 辐照可有效去除可移动遗传元件的含量，有效控制抗性基因的水平转移。但与此同时，越来越多的证据表明，UV 消毒在实践中不如预期。在实验室条件下，抗性基因mecA、vanA、tetA 和ampC 减 少3～4 log 需 要200～400 mj/cm2的紫外线剂量[70]，而在污水处理厂废水处理的实际应用中，UV 辐照几乎不能去除废水中tetM、tetO、tetQ、tetW、sul1、sul2 和intl1 等抗性基因[68,71]。这可能因为实验室所用的UV 辐照剂量较高，显著高于国内外消毒标准中所推荐的辐照剂量（80 mj/cm2）[72]。同时，实地应用中养殖水的浑浊程度、水体流速等因素，也会影响UV 对抗性基因去除的效果。由于光活化和暗修复机制的存在，当UV 去除微生物后还会产生复活现象[73-75]。因此，UV 辐照对水产养殖环境中的抗性基因去除效果仍需实地检测及评价。

2.3 臭氧消毒技术

臭氧是一种强氧化剂，通过直接氧化的形式与有机物迅速反应，也可与水基质生羟基自由基（·OH）间接地氧化大多数有机化合物。在阿莫西林、强力霉素、环丙沙星和磺胺嘧啶溶液中，随通入臭氧浓度持续升高，去除率增加，75 mg/L 的臭氧可去除95%的抗生素，且其分解副产物没有抗菌活性和毒性[76]。臭氧消毒的效率主要取决于臭氧剂量和暴露时间。当臭氧剂量达到125 mg O3/g DOC 且水力停留40 min 时，可完全去除8 种抗生素。当臭氧浓度为657 mg/L 水体停留时间为120 min 时，土霉素去除率可达96%，化学需氧量COD 和生化需氧量BOD 的去除效率分别为29%和33%[77]。然而，废水中的有机物质可能与臭氧直接进行反应，因此会造成抗生素的去除效率降低[78,79]。与UV 消毒相比，虽然臭氧对抗生素的去除效率高，但容易产生臭氧副产物（包括溴酸盐、氮氧化物）在养殖水体中大量积累，可能会对养殖对象甚至人体产生危害。

臭氧及·OH 会氧化破坏细菌细胞膜，然后直接破坏细菌的细胞器和DNA、RNA 等[80]。臭氧消毒对多种抗性细菌明显的杀灭作用，大肠杆菌（Escherichia coli）、葡萄球菌（Staphylococcus）和肠球菌（Enterococcus）在与0.73 mg O3/mg DOC 接触20 min后丰度直线下降[81]。经（0.9±0.1）g O3/g DOC 臭氧处理后，肠球菌、葡萄球菌、肠杆菌和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等抗性细菌的杀灭率为60.2%～98.9%不等，而抗性基因blaVIM、vanA、ampC和ermB 的丰度分别降低了18.7%、49.9%、69.8%和99.3%。臭氧处理对抗性基因和抗性细菌呈现不同的耐受比，可能与抗性细菌对臭氧的耐受程度不同有关[82]。与UV 消毒和氯化消毒相比，臭氧消毒对抗性细菌和抗性基因的消除能力更强[83]，这可能是由于细胞膜破损及蛋白质泄漏时，微生物的基因片段直接暴露在臭氧之中。然而，臭氧消毒在黑暗条件下也存在再生和活化现象[74]。

2.4 高级氧化技术

高级氧化工艺的特点是在特定反应条件下产生和使用·OH，将化学污染物、细菌、病毒等氧化和杀灭[84-86]。目前，常见的高级氧化技术包括光催化、芬顿反应等。光催化氧化对抗生素和抗性基因去除率较高，为高级氧化技术中最常用的方法。UV 辐照剂量为18.9 mj/cm2和40 mg/L 的H2O2联用，可完全降解氨苄西林、红霉素和四环素等物质[87]。对某城市废水中抗生素及其转化产物的消除研究发现，当UV 辐照剂量达到0.9 kJ/L，照射90 min 时，可完全去除废水中抗生素物质。当UV 与H2O2/Fe 联合使用，可在30 min 内完全去除抗生素。添加低剂量的过硫酸盐处理更有效，可在7～18 s 完全去除抗生素[88]。在过氧化氢浓度为0.01 mol/L 的条件下，UV/H2O2协同作用30 min 可使抗性基因丰度降低2.8～3.5 log，而UV 消毒和氯消毒仅能减少抗性基因丰度0.80～1.21 log 和1.65～2.28 log[89,90]。尽管研究结果表明UV/H2O2处理对抗性细菌和抗性基因有较高的去除效率，但对悬浮液中游离抗性基因的去除效果并不明显[91]。这可能是由于氧化剂的剂量低或者是由于·OH 与其他胞内物质反应无法作用于DNA 片段上[92,93]。与其他消毒方式相比，高级氧化技术对抗生素去除、抗性菌杀灭和抗性基因去除等效果良好，但需额外添加催化剂，成本高于紫外和氯化等消毒技术。

除此之外，水产养殖中常用的水处理方法还包括物理过滤、生物滤器、活性污泥及人工湿地等。利用物理法可能只会去除部分吸附于固体颗粒物上的抗生素和抗性基因，并不能从本质上去除水体中的抗生素和抗性基因，只是改变其存在位置。利用生物法处理养殖废水，抗生素可能会抑制微生物的活性，影响其水处理效能。在大规模废水处理厂中，蛋白杆菌、霉菌和活性杆菌等细菌（1.0%～8.2%）在活性污泥处理后并未被消除，反而促进了质粒在细菌间的转移[94,95]。活性污泥中微生物群落的密度和多样性较高，大量营养物质为微生物的生长提供环境，容易导致基因水平转移，甚至出现多重耐药基因。相较于臭氧等消毒工艺，生物法处理效果较慢且存在较高风险[96]。

3 未来及展望

抗生素及抗生素抗性基因在水产养殖环境中的频繁检出，严重影响我国水产养殖业。然而，因尚未有适用的测定方法，抗生素及抗性基因暂时并未列入养殖尾水排放的监管范围。目前研究热点主要集中在不同处理工艺对污水处理系统中抗生素和抗性基因的去除作用，而对于作为抗生素和抗性基因储存库的水产养殖环境相关的研究还较少。目前，水产养殖水处理过程中常用的几种处理方法对抗生素和抗性基因表现出不同程度的去除效果，但也存在较多问题。未来研究应立足于水产养殖，优化升级现有的消毒方式，以实现对抗生素和抗性基因的完全消除或阻止其发生转移。因此，今后相关科研应聚焦于以下几点:

（1）重视水产养殖中抗生素和抗生素抗性基因的污染问题，加强对养殖过程中抗生素使用的监管，避免由此带来的抗性基因污染及耐药性的产生

（2）加强多种消毒方式联用的研究。单一消毒方不能完全矿化或完全杀灭对抗生素及其抗性细菌的问题，而增大处理剂量可能会产生有毒副产物，多种消毒方式联用去除抗生素和抗性基因更加高效，如UV/H2O2、紫外光芬顿等。

（3）关注消毒过程中消毒副产物的生成。臭氧消毒方式可高效去除抗生素及抗性基因，但容易产生消毒副产物，UV 光解抗生素也可能生成毒性更高的中间产物，从而对养殖环境中其他生物产生毒害作用。