探讨肺泡灌洗液结核杆菌RNA、培养、涂片检查及结核感染T细胞斑点试验在肺结核诊断中的价值

樊亚丽，漆沄，孙欣荣，贺双

(1.西安医学院 研究生处，陕西 西安 710021；2.西安市胸科医院 妇儿结核科，陕西 西安 710000；3.西安市儿童医院 呼吸科，陕西 西安 710003)

结核杆菌引起的慢性传染性疾病叫结核病(TB)，众所周知TB是严重危害人类生命和健康的传染性疾病，自抗结核药物的使用，全世界的结核病发病率有显著的降低趋势，但是近些年来，全世界各国报道结核病又有回升趋势。我国的肺结核(PTB)患者占全球四分之一，是PTB高负担的国家之一。PTB的早期诊断，并及时进行有效治疗及隔离管理，能减少在人类中传播，避免造成危害人类健康的公共问题。

γ干扰素释放试验分析技术(IGRA)是一种体外免疫分析方法，可用来检测结核分枝杆菌感染，其中结核感染T细胞斑点试验T-SPOT.TB是基于全血的酶联免疫吸附分子技术(ELISPOT)和外周血单个核细胞(PBMC)培养的酶联免疫斑点技术。近年来，对支气管肺泡灌洗液进行T-SPOT.TB检测用来诊断肺结核病的应用价值也得到了证实，被大家所认可，成为另一种诊断肺结核病的较好的检测方法。本研究将通过结核杆菌RNA检查、培养、涂片以及T-SPOT.TB四种检测方法对219位疑似为肺结核患者的肺泡灌洗液进行检测，对此四种检测方法进行评估，了解各方法在肺结核病诊断中的应用价值，为肺结核病诊断提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年11月至2018年3月之间入住西安胸科医院并疑似为肺结核的219位患者为研究对象。

肺结核病诊断依据：根据2008年中华人民共和国卫生部出版的《肺结核诊断标准》来确诊断肺结核：①患者根据细菌学或病理检测证实并诊断肺结核；②患者有典型肺结核病影像学改变及临床症状，并且排除其他相似疾病，给予抗结核治疗后有效，即便实验室检测结果为阴性(如涂片、培养)，仍然被诊断肺结核病。本研究已通过伦理委员会批准通过。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料收集

收集所纳入的219位疑似为肺结核患者的相关资料，其包括：(1)一般情况：性别、年龄；(2)临床诊断及最终诊断；(3)实验室检测结果：肺泡灌洗液结核杆菌RNA检查，培养，涂片及T-SPOT.TB结果。

1.2.2 肺泡灌洗标本采集

肺泡灌洗液标本采集按照《纤维支气管镜临床应用指南(方案)》进行操作，留取标本。219位疑似为肺结核患者全部用纤维支气管镜在相应的病变部位选择相应的肺段进行灌洗留取肺泡灌洗液(BALF)作为标本。

肺泡灌洗结核杆菌RNA：半小时内将采集的样本及时送检，肺泡灌洗结核杆菌RNA将严格遵循结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(恒温扩增)的使用说明书进行操作检测。

肺泡灌洗结核杆菌培养：样本经过常规处理后，严格依照全国的结核病菌学检验标准化规程进行培养(酸性罗氏培养基)。

肺泡灌洗涂片找抗酸杆菌：标本采集后立刻送检，进行涂片抗酸杆菌染色，并采用电子显微镜进行镜检。报告标准为下：(1)阳性：①应用显微镜观察300个连续且不同的视野后，发现每100个视野中均有抗酸结核杆菌且数量为3到9条，则为(+)；②应用显微镜观察100个连续且不同视野后，发现每10个视野中均有抗酸结核杆菌且数量为1到9条，则为(2+)；③应用显微镜观察50个连续且不同视野后，发现每个视野中均有抗酸结核杆菌且数量为1到9条，则为(3+)；④应用显微镜续观察50连续且不同个视野后，发现每个视野中均能找到抗酸结核杆菌且数量≥10条，则为(4+)。(2)阴性：若应用显微镜观察300个连续且不同视野均未发现抗酸结核杆菌，则为阴性(-)。

T-SPOT.TB：标本采集后立刻送检，在样本中提取PBMC，进行培养显色，观察抗原A/B及阴性对照斑点数的情况来判定其阳性及阴性结果。结果判定标准为下。阳性：阴性对照孔斑点数＜6个，并且同时抗原A/B斑点数减阴性对照孔斑点数所得的差值＞6个或阴性对照孔斑点数≥6个，并且抗原A/B斑点数≥2×阴性对照孔斑点数。阴性：如果发现不符合上述条件，并且同时阳性质控对照正常。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0统计应用软件进行数据分析。中位数(四分位数间距)用来表示不符合正态分布的计量资料。%用来表示计数资料。组间灵敏度和特异度比较则是采用χ检验进行检验，均以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 入选患者基本情况

入选的219例疑似为肺结核患者中最终明确诊断为肺结核病患有113例，非肺结核106例。肺结核病患者中男性为63例，女性为50例，年龄为32岁(18～58岁)；非肺结核患者中男性为53例，女性为53例，年龄为36岁(18～59岁)。

2.2 在肺结核病的诊断中不同种检测方法灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及约登指数的比较

严格依据诊断标准诊断肺结核病，对四种检测方法进行比较，见表1。在本研究中对BALF进行结核杆菌RNA、培养、涂片以及T-SPOT.TB检测，在肺结核病的诊断中的灵敏度分别为：74.3%，45.1%，39.8%，85.0%，差异有统计学意义(χ=87.574，＜0.001)；只有BALF结核杆菌培养与涂片两种检测方法差异无统计学意义(χ=0.652，＞0.05)，其余检测方法两两对比差异均有统计学意义(χ=5.144，80.375，＜0.05)。本研究对BALF进行结核杆菌RNA、培养、涂片检查以及T-SPOT.TB检测，在肺结核病诊断中的特异度分别为：99.1%、98.1%、98.1%、93.4%，差异无统计学意义(=0.282)。

表1 对BALF进行结核杆菌RNA、培养、涂片、T-SPOT.TB检测结果比较

3 讨 论

结核分枝杆菌入侵患者呼吸道后引起的慢性传染性疾病叫肺结核。在传染病群中肺结核是危害人类生命健康的重要疾病之一，近些年来，肺结核发病率再度出现回升趋势，成为危害人类健康的公共问题之一。由于临床工作中有部分肺结核病患者的临床表现较不典型，影像学改变的特异度不明显，其传统对肺结核诊断以细菌性检查(痰培养等)为“金标准”，但其阳性率不高，所以诊断常较临床诊断有延误，因此有必要寻找一种敏感性及特异性强的方法为临床医师诊断肺结核提供依据。

在临床实践中，对于肺结核诊断常用的方法有痰培养、痰液涂片抗酸染色，其中痰培养为诊断肺结核的“金标准”。然而，由于在临床上很难从一些患者那里获得标本，从而影响检测结果；呼吸系统疾病诊断及治疗的重要辅助工具纤维支气管镜，它可以直接在病灶部位留取标本，不仅可提高了获得菌体的机会、降低标本的污染机率，而且适合无痰、标本留取困难的患者检测。本研究中就是留取BALF作为标本，对其进行结核杆菌RNA、涂片、培养及T-SPOT.TB检测，大大降低了其他因素对检测方法的干扰。

涂片检查因由于其价格低廉一直成为临床上用来诊断结核病常用方法之一。在本研究中发现，应用BALF进行结核分枝杆菌涂片检测，其检测特异度虽然较高，但在灵敏度均较其他三种方法低，考虑与涂片检查只能检测出来活力比较旺盛的菌体，同时其检测方法还受患者免疫功能改变及菌体的生物学特征变化的影响，并且受制于支气管镜灌洗中分枝杆菌数影响，故导致漏检人数较多，肺结核的患者不能及时进行有效治疗及隔离管理，致使病情进一步扩散。

肺结核病诊断的“金标准”是罗氏培养法，本研究中发现将BALF作为标本进行罗氏培养，其灵敏度为45.1%，较涂片检测39.8%高，但是其通过统计学分析显示两种方法在诊断肺结核中差异无统计学意义(＞0.05)，而且培养时间较长，常规需要2～8周，因此罗氏培养时间上也常常滞后于临床诊断及治疗，并且其假阴性率较高，同样增加了漏诊率和误诊率。

既往吴璇等人研究结果显示肺泡灌洗液SAT-TB检测具有较高灵敏度；此次研究中显示得出相似结果，肺泡灌洗液SAT-TB检测为74.3%，明显高于涂片检测及罗氏培养。SAT-TB检测可以区分出来活菌或死菌，在诊断肺结核比传统的PCR技术更好，准确率更高。但在本研究中发现T-SPOT.TB检测较SAT-TB检测更为有优势，其敏感度及特异度等较SAT-TB方法的更高。T-SPOT.TB是一种以特异性抗原为刺激源，同时采用ELISPOT诊断结核感染的新型检测方法。在本研究中显示，T-SPOT.TB灵敏度为85.0%，较其他三种方法均高，并与国内研究报道T-SPOT.TB的特异度及灵敏度均相似，这说明与其他三种检测方法相比T-SPOT.TB 在诊断肺结核中的真实性更大，而且T-SPOT.TB检测方法受激素等药物影响相比较小，但如果机体内特异性T细胞产生效率低下时会引起其结果的偏移，例如在机体发生细胞免疫之前采集标本，或患者为合并有免疫系统功能不全的重症结核患者，都可能会引起T-SPOT.TB检测结果为阴性，因此仍然不能单独根据T-SPOT.TB检测为阴性从而排除活动性结核，而应当结合临床表现等进行分析及诊断。

4 结 论

综上所述，以上四种方法在诊断肺结核病上各有其优缺点。相比之下，在此次研究的四种方法中对肺结核病的诊断具有较高的价值及临床指导意义的方法是T-SPOT.TB检测，但不能仅单靠该方法的阳性或阴性结果而诊治，当T-SPOT.TB检测结果为阴性时，还应考虑是否有干扰因素干扰，同时结合患者的临床表现、影像学的改变以及其他检测方法来诊治，从而提高诊断肺结核病灵敏度和特异度，减少误诊及漏诊率，一同作为诊断结核病的依据。