α-倒捻子素对阿尔茨海默病大鼠认知记忆功能的影响

★ 罗佳佳 胡英豪 钟长军 左坚 王秀（皖南医学院中西医结合研究中心 安徽 芜湖 241000）

阿尔茨海默病（alzheimer's disease, AD）是一种病因未明的慢性神经退行性疾病，目前尚无治愈或阻止AD 病程进展的特效药物。研究表明，AD的发生和发展可能涉及胆碱能损伤，β-淀粉样蛋白异常沉积，Tau 蛋白过度磷酸化，自由基损伤，氧化应激反应，神经血管功能退化等多种机制［1］。其中，β-淀粉样蛋白毒性假说占主导地位，Aβ的异常沉积可导致神经炎症，加重AD 患者的认知障碍［2］。研究表明，激活小胶质细胞表面α7-烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR）能减少β-淀粉样蛋白对神经细胞的损伤，对神经元产生保护作用［3］。α-倒捻子素（α-mangostin，MAN）分来自山竹的果壳，其具有增加乙酰胆碱，上调α7nAChR 表达，抑制炎症的作用［4］，表明MAN 抑制炎症的作用可能与胆碱能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）激动有关。通过建立AD 模型，观察MAN 对实验大鼠认知记忆功能的作用，并根据其对CAP 的干预作用，初步探讨上述治疗过程中涉及的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF 级雄性SD 大鼠36 只，体质量（160±20）g，由郑州市惠济区华兴实验动物养殖场提供，许可证号SCXK（豫）2019-0002，饲养于皖南医学院SPF 级动物中心。Aβ1-42（美国Sigma 公司，货号SCP0038）；D-半乳糖（上海MACKLIN 公司，批号C10888470）；大鼠 TNF-α ELISA Kit（批号：A38200623）、大鼠IL-1β ELISA Kit（批号：A301B00631）为杭州联科生物技术股份有限公司产品；CHRNA7 兔抗大鼠单克隆抗体（货号：A1588）、β-actin 兔抗大鼠多克隆抗体（货号：AC026）为武汉爱博泰克生物科技有限公司（ABclonal）产品；二抗兔抗（美国CST 公司，货号：7074P2）；苏木素伊红（hematoxylin eosin，H&E）染色试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，编号：C0105M）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与模型制备大鼠适应性喂养1 周后，随机分为正常组、模型组、MAN 组，每组12 只。模型组和MAN组以每天100 mg/kg剂量腹腔注射5% D-半乳糖，连续注射42 d，期间在第21 天于大鼠大脑右的侧海马区注射Aβ1-425 μL，Aβ1-42的浓度为2 μg/μL。正常组不做任何处理。大鼠海马区注射Aβ1-42具体操作如下：大鼠麻醉后，剪去头部两耳间毛发，固定于大鼠脑立体定位仪上，消毒皮肤，然后剪开头部皮肤，暴露颅骨，找到前囟，在前囟点向后4.4 mm，向右2.2 mm 的位置作一标记，作为Aβ注射点，用10 mL注射器针头缓缓钻通该点颅骨，用微量注射器吸取5 μL Aβ1-42溶液，从注射点向下进针2.8 mm 到达海马区，缓慢推注，药物推完后留针5 min，再缓慢退针。然后缝合伤口，皮下注射4万IU 青霉素钠预防感染。

从第22 天开始，MAN 组以40 mg/kg 剂量灌胃给药，连续灌胃21 d，模型组和正常组以等体积生理盐水代替药物。

1.2.2 Morris 水迷宫实验 Morris水迷宫分为6 d定位航行试验和1 d 空间探索试验，用于检测大鼠的学习记忆能力和空间探索能力。定位航行试验：水迷宫水池分为4 个象限，将平台放置在第2 象限中间，往水池中放水直至高出平台3 cm 左右，向水中加入墨汁混匀，使水变黑，看不见水里的平台。实验开始前，先撤去水中平台，将大鼠放入水池里适应性游泳90 s，以熟悉水池环境。实验正式开始，将大鼠面向池壁从任一象限的同一位置放入水中（4 个象限轮流进行），并点击电脑Morris 水迷宫开始程序，记录大鼠在90 s内找到平台所需要的时间，即为大鼠上平台潜伏期，以及大鼠上台前的游泳路程。大鼠找到平台后，让其在平台上休息10 s，然后取出擦干，放回笼内休息1 min，再进行下一象限的测试。若大鼠在90 s 内不能找到平台，则上平台潜伏期记为90 s，由实验人员将其引导至平台上，同样休息10 s。实验连续做6 d。第7 天时撤去水中平台，将第4 象限的中点作为入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠90 s 内穿越原平台位置的次数以及大鼠在该象限内停留的时间。

1.2.3 ELISA 法检测大鼠血清中TNF-α、IL-1β的浓度大鼠麻醉后，剪开腹腔，从腹主动脉采集血液，将血液贮存在促凝管中，静置2 h，然后以3 000 r/min 转速离心10 min，收集上清，按试剂盒说明书要求测定TNF-α、IL-1β 浓度。

1.2.4 组织切片及病理学观察行为学实验结束后第2 天，用10%水合氯醛麻醉大鼠。大鼠深度麻醉后，用生理盐水和4%多聚甲醛对大鼠进行心脏灌注，灌注完成后快速断头取脑，并将取出的脑组织进一步固定于4%多聚甲醛。 待24 h 后完成组织固定，取视交叉至大脑横裂部份的脑组织，进行石蜡包埋，以5 μm 左右厚度，进行冠状切片。经HE 染色后，光学显微镜下观察细胞形态学变化。

1.2.5 Western Blot 法检测大鼠海马α7 受体表达取0.05 g 大鼠海马组织，用生理盐水洗2 次，吸水纸吸干水分，置于2 mL 无菌离心管中，加入500 μL现配的含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液，在冰冷条件下以匀浆器匀浆处理，继续置于冰上裂解30 min，之后在4℃下以12 000 rpm 速度离心10 min，取上清。所得样本经BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度后加入蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min 变性处理。所得样本上样于10%的SDSPAGE 胶，进行蛋白电泳，随后将分离后蛋白电转至聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）上，用5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min，一抗α7 抗体4 ℃孵育过夜，TBST 洗膜3 次，室温孵兔抗二抗1 h，再用TBST 洗膜3 次。在全自动化学发光凝胶成像分析系统设备上以ECL 化学发光液曝光，显影。使用image J 记录条带灰度值，进行归一化处理。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件，实验结果以均值±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris 水迷宫实验

2.1.1 MAN 对AD 大鼠定位航行功能的影响定位航行试验中，随着训练次数的增加，各组大鼠上平台潜伏期呈现缩短趋势。与正常组比较，模型组大鼠在第3 天以后上平台潜伏期明显延长，上平台前的路程也明显增多，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，MAN 组大鼠上平台潜伏期时间在第4 天以后明显缩短，上台前路程也明显缩短，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1-2。

表1 MAN对AD大鼠上平台潜伏期的影响（±s，n＝12） s

表1 MAN对AD大鼠上平台潜伏期的影响（±s，n＝12） s

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 第1 天 第2 天 第3 天 第4 天 第5 天 第6 天正常组 76.78±11.72 66.57±7.35 52.14±7.40 40.08±9.46 25.61±8.17 16.95±4.59模型组 79.61±14.80 73.79±15.52 65.93±9.70* 55.16±6.66** 37.96±5.28* 25.33±5.01*MAN 78.84±11.96 69.26±8.14 60.59±5.91 42.99±4.93# 28.88±6.17# 18.05±4.90#

表2 MAN对AD大鼠上台前路程的影响（±s，n＝12） mm

表2 MAN对AD大鼠上台前路程的影响（±s，n＝12） mm

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 第1 天 第2 天 第3 天 第4 天 第5 天 第6 天正常组 1 690.29±132.03 1 477.46±225.48 985.04±110.27 754.92±217.35 533.09±178.86 296.91±94.53模型组 1 882.34±185.82 1 758.00±171.22 1 389.10±227.53** 1 171.26±235.68** 854.26±192.64* 589.30±186.06*MAN 1 749.45±217.56 1 581.94±334.38 1 228.02±256.46 868.13±375.57# 642.35±171.04# 422.14±185.94#

2.1.2 MAN 对AD 大鼠空间探索功能的影响在空间探索试验中，与正常组比较，模型组大鼠穿越平台的次数和目标象限逗留时间均明显减少（P＜0.01）；而MAN 组的大鼠穿越平台的次数和目标象限的逗留时间均明显增加（P＜0.05）。见表3。

表3 MAN对AD大鼠平台穿越次数和目标象限停留时间的影响（±s，n＝12）

表3 MAN对AD大鼠平台穿越次数和目标象限停留时间的影响（±s，n＝12）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 平台穿越次数/次 目标象限逗留时间/s正常组 8.0±1.91 46.94±7.79模型组 4.29±1.98** 29.29±6.17**MAN 组 6.86±1.35# 42.06±9.04#

2.2 MAN 对AD 大鼠血清中TNF-α、IL-1β 浓度的影响

模型组大鼠血清中TNF-α 和IL-1β 水平较正常组显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，MAN 组TNF-α、IL-1β 水平明显降低（P＜0.01，P＜0.05）。见表4。

表4 MAN对AD大鼠血清中TNF-α、IL-1β浓度的影响

2.3 MAN 对AD 大鼠海马中α7nAChR 表达的影响

模型组大鼠海马α7nAChR 表达跟正常组比较，明显下调，差异具有统计学意义（P＜0.01）；MAN 组的AD 大鼠海马α7nAChR 表达明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。见图1。

图1 MAN对AD大鼠海马中α7nAChR表达的影响

2.4 MAN 对AD 大鼠海马CA1 区的形态学的影响

正常组大鼠海马CA1 区神经细胞排列整齐，细胞核圆大，细胞结构完整、清晰；模型组大鼠海马CA1 区大部分细胞正常结构消失，细胞变形，胞核区域深染，胞核肿胀、碎裂，形态不规则，大量神经元变性；MAN 组相较模型组，细胞排列较为整齐，细胞结构比较清晰，排列规则。见图2。

图2 MAN对AD大鼠海马CA1区组织形态的影响（×400）

3 讨论

随着社会人口进入深度老龄化阶段， AD 患者群体总量不断增加。预计到2050 年，仅我国AD患者人数就将超过3 000 万［5］。AD 起病隐匿，逐渐发展导致认知记忆功能、语言功能和生活独立性的丧失，严重影响患者的身心健康，加重家庭和社会的负担。MAN 是一种天然多酚，主要分布在山竹果皮中，其具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、神经保护等作用［6～8］。研究发现MAN 可同时抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）活性，促进α7nAChR 表达，从而有效激活CAP，改善外周免疫环境［9］，从而表现出良好的抗炎作用［10］。与上述活性一致，MAN 可以改善抑郁症模型大鼠的认知缺陷和抑郁表现［11］。本研究发现，行为学方面，MAN 缩短了AD 大鼠的上平台潜伏期和上台前路程，增加了平台穿越次数、目标象限停留时间。同时，MAN 降低AD 大鼠血清中TNF-α、IL-1β 水平，上调海马中α7nAChR 蛋白表达，复性调控作用同步伴随着AD 大鼠海马CA1 区神经细胞的病理变化的显著改善。提示MAN 具有一定改善AD 大鼠认知记忆功能的作用。

近年来，炎症与AD 的关系受到越来越多人的关注。小胶质细胞是中枢神经系统内固有的免疫效应细胞，在AD 中小胶质细胞过表达的炎症反应，释放炎症介质，如炎性细胞因子、补体成分、趋化因子等，促进β 淀粉样蛋白沉积、tau 蛋白过度磷酸化，加剧神经退行性变［12-13］。文献报道，MAN能够抑制癫痫小鼠海马神经元凋亡，降低其炎症水平，改善空间记忆能力［14］。α-倒捻子素衍生物能减轻再灌注引起的炎症损伤，并改善血管性痴呆大鼠的认知功能［15］。在本研究中，MAN 能够降低AD 大鼠血清中TNF-α、IL-1β 水平，减轻体内炎症反应。

CAP 是一种神经免疫调节通路。迷走神经刺激下释放的乙酰胆碱与α7nAChR 结合，神经系统能快速显著的抑制巨噬细胞释放炎症因子，如TNF-α，减轻全身性炎症反应［16］。α7nAChR 是CAP 的核心组成，激活α7nAChR 可以抑制IL-1、IL-6、IL-8 等炎症细胞因子的释放［17］。α7nAChR属于烟碱型乙酰胆碱受体，由5 个α7 单体组成的配体门控离子通道，是研究阿尔茨海默病和精神分裂症治疗的一个重要靶点［18］。α7nAChR 在中枢和外周均有分布，神经元型α7nAChR 广泛分布于海马、大脑皮质、下丘脑，具有抗炎及神经保护作用［19］。研究发现，激活α7nAChR 能促进脑胆碱能信号的调节，增强认知功能，改善AD 的病理表现［20］。同时，α7nAChR 激动剂可以增加脓毒症脑病小鼠的M2 型小胶质细胞数量，减轻脑内炎症反应，改善小鼠的认知记忆能力［21］。本研究结果表明MAN 能够上调AD 大鼠海马中α7nAChR 的表达，改善AD大鼠在水迷宫定位航行和空间探索试验中的表现，与上述报道结果一致。组织病理结果显示，经MAN治疗后的AD 模型大鼠海马CA1 区神经细胞结构比较完整，无明显细胞破裂，进一步验证了上调的α7nAChR 表达对神经细胞具有保护作用。提示MAN 改善AD 大鼠认知记忆能力可能与其缓解了脑内炎症反应有关。

综上，MAN 具有上调AD 大鼠海马α7nAChR表达，改善AD 大鼠认知记忆功能的作用。这一作用可能与α7nAChR 表达增加激活CAP，抑制IL-1β、TNF-α 炎症因子的释放，减轻脑内炎症对神经细胞的损害有关。