象皮生肌膏对慢性创面大鼠肉芽组织TGF-β1、EGFR、FN 蛋白表达的影响

★ 程学荣 李木清 张月娟 李成丽 姜雄 杜攀攀 毛滔 杨振武（.湖南中医药大学第二附属医院 长沙 0005；.湖南中医药大学第一附属医院 长沙 0007；.长沙市中医院 长沙 000；.湖南中医药大学 长沙 08）

骨科创伤患者往往会有大面积的皮肤软组织缺损，伤口在短时期内难以愈合，已发展为慢性创面，传统的骨科创伤治疗方法有一定的弊端，如处理不当，迁延不愈，容易引发感染，最终导致解剖和功能上的缺陷［1］。象皮生肌膏在临床皮肤损伤修复、促进创面愈合的治疗中有着显著的效果［2］，本实验采用象皮生肌膏对慢性创面大鼠进行治疗，观察创面新生组织中TGF-β1、EGFR 及FN 蛋白的表达及创面愈合率的变化，从微观角度阐述其促愈合的作用机制，丰富其“祛腐生肌”的科学内涵［3］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物Sprague-Dawley（SD）大鼠72 只，SPF 级，雄性，12 周龄，220～250 g，由湖南中医药大学动物实验中心（动物使用许可证号：SYXK＜湘＞2019-0009）代购于湖南长沙斯莱克景达（动物生产许可证号：SCXK＜湘＞2019-0004），动物分笼饲养，自由摄食、饮水，室温（20±2）℃，适应性喂养1 周后进行实验。实验中对动物处置符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.1.2 材料10%水合氯醛（北京雷根生物技术有限公司，批号：0528A20）;象皮生肌膏（湖南中医药大学第一附属医院制剂室制备，湘药制字Z20070276，生产批号20200121）;重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶（珠海亿盛生物制药有限公司，产品批号：04481212）；醋酸氢化可的松（上海源叶生物科技有限公司，产品编号S47632）。

1.1.3 主要仪器台式冷冻离心机（中国湖南湘仪）；电子天平（美国双杰）；精密pH 计（中国雷磁）；转膜仪（中国北京六一）。

1.2 方法

1.2.1 造模方法参考付小兵等的创面造模方法［4］：造模前24 h，72 只大鼠均禁食禁水，用棉签刺激其肛门部排空大便，用10%水合氯醛腹腔注射（按每只大鼠0.3 mL/100g 的剂量注射，注意勿注射入大鼠肠腔以及膀胱）进行麻醉。麻醉成功后，将大鼠俯卧位固定，腰椎正中偏上约4 cm×4 cm 大小皮肤处予脱毛膏脱毛。脱毛干净后置于净化台上，手术区常规消毒，铺无菌单，选择背中部脊柱右侧旁开0.5 cm 距肩胛骨以下2 cm 处制备直径20 mm深至皮下深筋膜层的圆形创面，注意用眼科刀切除表皮和真皮，深至皮下深筋膜层，按照80 mg/kg标准注射醋酸氢化可的松将实验组、对照组、模型组3 组大鼠建成慢性创面模型。空白组仅背部备皮处理。

1.2.2 动物分组从72 只SD 大鼠中随机挑选18只为空白组，其余64 只制备慢性创面模型后，随机分为实验组、对照组和模型组，每组18 只。

1.2.3 处理方法实验组：创面用5%碘伏消毒再用生理盐水棉球擦净后在创面涂抹约1 mm 厚的象皮生肌膏，再用无菌敷贴覆盖创面，用胶布加以固定，早晚各予以一次换药。对照组：创面用5%碘伏消毒再用生理盐水棉球擦净后在创面涂抹约1 mm 厚的重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶，再用无菌敷贴覆盖创面，用胶布加以固定，早晚各予以一次换药。模型组：创面用5%碘伏消毒再用生理盐水棉球擦净后，再用无菌敷贴覆盖创面，用胶布加以固定，早晚各予以一次换药。空白组：备皮处局部用5%碘伏消毒后以生理盐水外涂，再用无菌敷贴覆盖创面，用胶布加以固定，早晚各予以一次换药。

1.2.4 疗效评价方法于肉眼及显微镜下观察创面愈合情况。于治疗后第3、7、14 天随机挑选6 只处死并取同一部位的创面组织为标本，采用westernblot 检测EGFR、TGF-β1、FN 蛋白在创面中的表达。

1.2.5 创面愈合率的计算分别在治疗后的第3、7、14 天用透明膜描记法绘得创面的图形，再将图形描至小方格纸，以小方格的格数表示创面面积，与治疗前比较，计算每只动物不同时间的创面愈合百分率。创面愈合率＝（原始创面面积－未愈合创面面积）／原始创面面积×100%。

1.2.6 统计学方法采用SPSS 25.0 统计软件分析，计量资料用“均数± 标准差”（±s）表示，若满足方差齐性检验则采用单因素方差分析，然后采用LSD 检测两两比较，若不满足方差齐性检验则采用非参数秩和检验，然后采用Mann-WhitneyU 两两比较，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组创面溃疡组织形态学观察

空白组皮肤结构完整，表皮无坏死脱落，无出血、无炎细胞浸润。造模后第3 天，模型组、实验组、对照组均可见坏死表皮组织，大量炎性细胞浸润，实验组、对照组可见大量新生毛细血管，两组较模型组丰富；造模后第7 天，模型组仍有大量炎性细胞，实验组及对照组有大量成纤维细胞分布，毛细血管丰富。造模后第14 天，实验组及对照组大量成纤维细胞分布，毛细血管丰富，模型组炎性细胞较前减少，纤维细胞散在分布。见图1。

图1 HE染色结果（×200）

2.2 各组创面愈合率比较

模型组的愈合率第3、7、14 天均低于实验组、对照组（P＜0.05）；实验组和对照组第3 天无明显差异，第7 天实验组愈合率高于对照组（P＜0.05），第14 天实验组与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组创面愈合率比较（±s，n=6） %

表1 各组创面愈合率比较（±s，n=6） %

注：与实验组比较，*P＜0.05；与对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

组别 3 d 7 d 14 d模型组 1.28±0.01*# 14.92±0.03*# 59.03±0.02*#实验组 6.15±0.01▲ 35.40±0.02▲# 82.23±0.01▲对照组 6.83±0.01▲ 29.10±0.04*▲ 81.48±0.03▲

2.3 各组TGF-β1 表达水平比较

在局部处理后的第3、7、14 天，空白组中TGF-β1 表达水平无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组与实验组及对照组相比第3、7、14 天创面组织中TGF-β1 均处于低表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）；对照组第3、7、14 天均高于模型组（P＜0.05），处理第7 天达到最高峰，第14 天时呈现下降趋势；实验组前后表达较稳定，与模型组相比第3、7、14 天均显著高表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2 和图2。

表2 各组TGF-β1表达水平比较（±s，n=6）

表2 各组TGF-β1表达水平比较（±s，n=6）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

组别 3 d 7 d 14 d空白组 41.34±5.79▲# 51.27±6.00▲# 46.64±8.26▲#模型组 20.85±3.57*# 32.95±7.92*# 25.03±10.37*#对照组 55.75±3.50*▲ 62.77±6.62*▲ 58.88±5.34*▲▲实验组 64.53±6.74*▲# 71.13±10.59*▲ 73.74±9.81*▲#

2.4 各组EGFR 表达水平比较

在局部处理后的第3、7、14 天，空白组中EGFR 表达水平差异无统计学意义。处理第3 天与模型组比较，对照组及实验组显著高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。处理第7 天，实验组及对照组均显著高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；处理第14 天，实验组及对照组创面接近痊愈，EGFR 表达增长趋势总体趋缓，模型组增长趋势加快，在跟其它组比较中其表达更高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3 和图2。

表3 各组EGFR表达水平比较（±s，n=6）

表3 各组EGFR表达水平比较（±s，n=6）

注：与第3天比较，▲P＜0.05；与第7天比较，△P＜0.05；与对照组比较，*P＜0.05；与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，◆P＜0.05。

组别 3 d 7 d 14 d空白组 19.67±3.54◆* 19.49±2.99◆* 29.82±12.29◆*模型组 44.04±3.03#* 38.85±2.80#* 81.15±4.78#*对照组 59.59±1.93#◆ 58.12±5.16#◆ 65.50±6.06#◆△实验组 58.32±1.96#◆ 65.37±3.69#◆* 71.29±7.66#▲△

2.5 各组FN 表达水平比较

在局部处理后的第3、7、14 天，空白组组织中FN 表达水平前后差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组处理第3、7、14 天FN 表达均低于实验组及对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），总体呈逐渐缓慢递增趋势。实验组表达显著高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05），处理第3、7、14 天逐渐递增。对照组处理第3、7、14 天均高于空白组及模型组（P＜0.05），差异具有统计学意义，但与实验组相比相对偏低，总体呈递增趋势。见表4 和图2。

表4 各组FN表达水平比较（±s，n=6）

表4 各组FN表达水平比较（±s，n=6）

注：与第3天比较，▲P＜0.05；与第7天比较，△P＜0.05；与对照组比较，*P＜0.05；与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较，◆P＜0.05。

组别 3 d 7 d 14 d空白组 39.05±4.19◆* 48.98±14.88◆ 40.53±16.30◆*模型组 19.96±2.43#* 26.86±10.95#* 59.19±14.11#▲△对照组 55.60±7.12#◆ 62.41±7.80◆ 73.67±9.60#▲实验组 61.27±5.36#◆ 70.17±12.75#◆ 78.62±4.22#◆▲

图2 各组不同时间蛋白表达情况

3 讨论

慢性创面是骨伤科常见症状，若处理不当，会使创面迟迟不能愈合，最终给患者带来解剖和功能上的缺陷，运用中医药防治本病的发生发展是保障人类健康的重大需求。古人在治疗慢性创面上累积了一定经验，认为应当遵守“祛腐生肌”的理念，祛腐可以生肌，早在《刘涓子鬼遗方·痈疽证治方》就有相关论述，指出“治死肉臭秽与高肉相缀，须用猪蹄汤熨拭，令死肉相离，别生好肉，猪蹄汤方”［5］。清代吴谦著《医宗金鉴》更确切的指出“腐者，坏肉也……腐不去则新肉不生”［6］。大量临床实践证实［7］，慢性创面中称之为“腐”的坏死组织不仅难以愈合，而且还能阻碍正常组织尤其新生肉芽的生长，因此通过对创面合理清创，清除坏死组织，使原来的慢性创面成为新鲜的急性创面，新的创面才会有新生肉芽组织生长出来，即“腐去肌方生”；同样，生肌亦可祛腐。象皮生肌膏出自《疡科纲要》，药物组成主要包括：象皮、当归、地黄、血余炭、炉甘石、石膏等。其中象皮止血、敛疮；当归补血活血、排脓生肌、消肿止痛；地黄清热生津、滋阴凉血；血余炭消瘀止血；炉甘石解毒收湿、止痒敛疮；石膏清热泻火解毒；诸药合用能调和阴阳气血，使而祛腐生肌［8］。

创面愈合是一个多种因素参与的复杂生物过程，大致分为3 个相互重叠的阶段,即炎症期、增殖期和重塑期，此过程受到神经、内分泌以及激素变化等诸多方面的影响［9］。研究表明，慢性创面的机制主要在于局部创面生长因子浓度的变化、修复细胞的过度凋亡以及创面细胞外基质成分的基因表达下调等，因此创面愈合分子即细胞因子、受体、神经递质等化学信号分子［10］。这些微观分子具有多效性、重叠性、拮抗性和协同性等特点，它们构成一张复杂的神经-内分泌-免疫网络,调控着机体的功能活动。因此，可以通过调节这些微观分子的平衡从而达到对整体功能的调控作用，从而促进创面的愈合。EGFR 作为配体表皮生长因子触发细胞增殖、修复、分化、存活的重要受体［11］，在创伤修复过程中表达增加、活性增强，并呈现一定的时相性［12］。FN 是一类分子量为440～550 kD 的糖蛋白, 广泛存在于机体许多组织中，具有促进伤口愈合作用, 并参与创伤修复的全过程［13］。FN 作为一种黏合剂, 在正常皮肤下组织含量极微，当皮肤发生溃烂时，可与纤维原、纤维蛋白原、肝素及硫酸肝素和胶原相结合, 共同形成基质, 促进肉芽组织的生长以及表皮移行，在创面修复中起着重要作用［14］。临床及基础研究均证实TGF-β1 作为转化生长因子中的一员，是成纤维细胞最强的趋化因子，在促进成纤维细胞增殖、迁徙、分化中起重要作用［15-16］，TGF-β1 与溃疡愈合面积呈高度正相关。新生血管的形成、肉芽组织的再生和结缔组织的形成均与 MMP-2 和TIMP-2 密切相关［17］，而TGF-β1 可通过增强TIMP-2，抑制MMP-2 的基因表达，促进新生血管生成，参与创面修复。

本次研究显示，在局部处理后的第3、7、14 天，TGF-β1、EGFR、FN 在空白组大鼠局部皮肤组织中表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），组织形态学无明显差异。与空白组比较，实验组、对照组、模型组大鼠创面组织中TGF-β1、EGFR、FN 表达水平变化均较明显，差异具有统计学意义（P＜0.05）。实验处理第3 天，与模型组比较，实验组及对照组TGF-β1、EGFR、FN 均显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。实验第7 天，与模型组比较，实验组及对照组TGF-β1、FN、EGFR 均显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。实验第14 天，实验组及对照组TGF-β1、FN 显著高于模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05），实验组及对照组EGFR蛋白第14 天增长减缓，模型组增长明显。空白组皮肤结构完整，表皮无坏死脱落，无出血、无炎细胞浸润，前后无明显差异。研究证明实验组、对照组组织形态学观察与同期较模型组相对恢复更好。说明象皮生肌膏可促使大鼠创面TGF-β1、EGFR、FN增多, 进而促进创面细胞增殖、生长。

综上所述，象皮生肌膏能够提高大鼠创面组织中TGF-β1、EGFR、FN 蛋白的表达水平，促进慢性创面的愈合，丰富了其“祛腐生肌”的科学内涵，为临床应用象皮生肌膏治疗慢性难愈合创面提供可靠的实验依据。然而，象皮生肌膏的作用机制复杂，且本次研究只进行了蛋白层面的研究，不能完全阐述象皮生肌膏促进慢性创面愈合的作用机制，下一步将深入基因层面进行探讨研究。