微生物混合培养生产油脂的研究进展

张 勇，陈 燕，李欣阳，王全颖，张永丰，王秋珍

(1.国家海洋局秦皇岛海洋环境监测中心站, 河北 秦皇岛 066002; 2.河北农业大学 海洋学院, 河北 秦皇岛 066000)

在自然生态环境中，微生物之间具有错综复杂的互作关系(如互利共生、竞争拮抗等)，通过调控自身以及其他生物的生长、生理和代谢活动，不断适应变化莫测的外界环境。在实验室纯培养条件下微生物能够调节自身活动以适应人工培养条件，生长和代谢活动均发生显著改变，最终导致可培养性和代谢产物的变化。混合培养方式能够促进微生物之间的物质、能量和信息交流，使微生物对碳、氮等营养物质的同化作用加强，促使更多的碳流向碳水化合物[1]。因此，采用混合培养方法获得的微生物生物质在食品、饲料、化工、可再生能源等方面具有更大的应用潜力。

全球范围内能源消耗和环境污染问题的加剧，促使人类对于生物质能源的探究更加深入。微生物油脂作为一种绿色可再生能源，不仅是合成生物柴油的重要底物，而且是很多功能化学品的重要来源。因此，通过微生物混合培养方式实现微生物油脂的高效生产对于解决当前的能源与环境问题具有重要意义。本文对微生物混合培养生产油脂的现状进行了综述，以期为微生物油脂的高效生产提供参考。

1 微生物油脂概述

随着化石燃料的不断消耗，生物质能源的研究愈加深入。微生物具有生长迅速、底物来源广泛、油脂含量高的特点，是生物质燃料和天然活性产物的重要来源。某些微藻、真菌、原生生物和细菌等微生物均能合成大量的脂类物质，组成这些脂质的脂肪酸主要为中长链(14～22个碳原子)的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸[2-3]。其中：含有14～18个碳原子的饱和脂肪酸如十四烷酸(C14∶0)、棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)等，以及单不饱和脂肪酸如棕榈油酸、油酸等，是制备生物柴油的优良底物[4]；而长链多不饱和脂肪酸如二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、花生四烯酸(AA)和γ-亚麻酸(GLA)等具有重要的生理功能，在食品、医药、保健、饲料等行业具有重要的应用价值[5-6]。

微生物油脂的合成受多种因素的影响，其中培养基组成(碳源、氮源、无机盐等)和环境条件(温度、pH、盐度等)是工艺优化中研究最多的[2]。充足的碳源有利于微生物的快速生长，而限氮和低温条件则能够促进微生物细胞内油脂的累积。在操作模式上，与分批发酵相比，补料分批发酵更有利于微生物的生长和代谢产物的合成，但生产成本也更高。另外，某些微生物之间混合培养可以通过营养互补和信息交流互相促进彼此的生长和产物合成，同时结合培养条件的优化，最终比微生物单独培养表现出更高的生物量和油脂产量。

2 微生物混合培养生产油脂的现状

目前，关于微生物混合培养生产油脂的研究主要集中在藻-菌混合培养方面。藻-菌之间明显的营养互补优势，使其在废弃物处理和微生物油脂生产方面备受瞩目。菌-菌混合培养虽然研究得比较早，但近些年相关研究并不多；而藻-藻混合培养的研究较为缺乏。

2.1 藻-菌混合培养

藻-菌混合培养主要是微藻与酵母或细菌之间的混合培养。用于混合培养的微藻主要包括小球藻[7-8]、栅藻[9-10]、小椿藻[11]、雨生红球藻[12]、斜生四链藻[13]等；酵母主要包括粘红酵母[3,14-16]、圆红冬孢酵母[17-18]、酿酒酵母[2,19]、解脂耶氏酵母[20-21]等；细菌包括巴西固氮螺菌[9]、微藻共生菌[10]等。微藻与酵母混合培养具有诸多优点，是混合发酵中应用最多的微生物组合，其中小球藻与粘红酵母混合培养生产油脂的研究最多(表1)。一方面，微藻对有机物的降解能力较弱，但能够利用底物中的大量无机物，通过光合作用吸收环境中的二氧化碳并释放氧气，而酵母菌在有氧条件下可利用底物中的大量有机物进行自身的代谢，释放出二氧化碳。因此，微藻与酵母混合培养能够通过营养互补、气体交换和pH调节等机制，促进微生物代谢产物的合成和底物的有效利用。并且，微藻释放的一些次生代谢产物可以作为化感物质刺激酵母细胞的生长[14]。另外，在光照条件下微藻也可以与细菌在人工培养基和废弃物中进行混合培养。小球藻ChlorellavulgarisSAG 211-19与需氧细菌混合培养可以处理水产品加工废水，培养14 d后，小球藻的生物量和油脂含量分别达到0.82 g/L和32.15%[22]。栅藻可以与巴西固氮螺菌AzospirillumbrasilenseATCC 29145或自身共生细菌进行混合培养[11-12]。

接种量和接种时间是影响藻-菌混合培养生长和油脂累积的重要因素。多数研究在进行藻-菌混合培养时，同时接种一定比例的藻液和菌液，并且藻液的细胞密度高于菌液。Zhang等[14]研究表明，同时接种不同比例的小球藻Chlorellavulgaris与粘红酵母Rhodotorulaglutinis(CGMCC No. 2258)进行混合培养，当藻和菌的种子液接种比例均为3%时，其生物量和油脂产量分别为10.3 g/L和1.56 g/L，而当藻和菌的种子液接种比例分别为6%和3%时，其生物量和油脂产量分别为8.7 g/L和1.03 g/L。因此，微藻接种比例的增加会抑制菌体的生长和油脂累积。另外，少数研究先接种菌液，当菌体生长进入对数期以后，再接种藻液[17]。

微藻可以进行自养、异养和混合营养生活，微藻在进行纯培养时多数利用光合作用进行光自养生活。而在藻-菌混合培养时，光自养仍然是微藻的主要生活方式，但在暗发酵的异养条件下，培养体系中其他微生物的存在能够提高微藻对难降解底物的利用效率。在异养条件下单一微藻培养难以利用二糖，但蛋白核小球藻Chlorellapyrenoidosa与粘红酵母Rhodotorulaglutinis在蔗糖条件下进行混合培养时，蛋白核小球藻却可以利用由粘红酵母水解蔗糖生成的葡萄糖和果糖，摇瓶培养5 d后，其油脂含量达到30%以上(占细胞干重的比重)[15]。与自养方式相比，异养方式不需要光照，对环境和发酵设备的要求更低，在规模化生产中更具优势。

表1 小球藻与酵母混合培养生产油脂的研究

2.2 藻-藻混合培养

微藻与微藻之间混合培养生产油脂的研究较少，为数不多的研究表明栅藻可以与雨生红球藻、小球藻、野生藻类等进行混合培养[24-26]。一方面，混合培养微藻之间由于对营养成分的竞争导致培养液中总氮浓度的降低，以此作为环境压力有利于藻类细胞内油脂的合成[24]。另一方面，混合培养微藻释放的可溶性藻产物能够促进彼此的光合作用和同化作用，促进藻细胞的生长和油脂合成[24]。小球藻Chlorellavulgaris与二形栅藻Scenedesmusdimorphus同时接种至人工培养基中培养10 d后，油脂产量和油脂含量达到3.84 g/L和10.9%[25]。栅藻Scenedesmussp. LX1与雨生红球藻Haematococcuspluvialis混合培养可以用于处理生活二级废水(Domestic secondary effluent)，同时接种不同比例(藻-藻细胞干重的比例4∶1、1∶1和1∶10)的两种微藻时，其生物量可达到0.51～0.54 g/L；并且在接种比例为4∶1时，生物量最大[24]。故接种比例影响混合培养微藻的生长和油脂累积。此外，以模拟城市污水为发酵底物，栅藻ScenedesmusobliquusFACHB 416与池塘或湖泊野生藻可以进行混合培养，但其油脂产量显著低于栅藻单独培养[26]。因此，藻-藻混合培养能够用于多种废弃物的处理和油脂的生产，但对底物的利用效率普遍不高，并且藻类之间的混合培养工艺研究尚且缺乏，仍有待进一步探究。

2.3 菌-菌混合培养

菌-菌混合培养中经常使用的真菌包括酵母和霉菌，多用于发酵农业废弃物如玉米秸秆[27]、谷氨酸发酵废水[28]、丢糟[29]等。一般在采用的混合菌株中，至少有一种菌株具有较强的大分子物质降解能力，另外的菌株则具有较强的油脂累积能力。假丝酵母Candidasp.具有较强的纤维素等多糖降解活性，而皮状丝孢酵母TrichosporoncutaneumGIM 2.68油脂累积能力强，两者混合培养可用于发酵丢糟，在最适培养条件下发酵4 d后，油脂转化率达到2.114%[29]。玉米秸秆含有丰富的纤维素成分，可以用作多菌种发酵生产油脂的底物。利用绿色木霉Green wooden mould GIM 3.139、烟曲霉AspergillusfumigatusFreseniusGIM3.421与皮状丝孢酵母TrichosporoncutaneumGIM2.68混合发酵玉米秸秆，在最适条件下油脂转化率可达1.247%[27]。其中绿色木霉和烟曲霉具有较强的纤维素降解活性，生成的五碳糖和六碳糖可用于皮状丝孢酵母油脂的合成。此外，酿酒酵母可以分别与德式乳酸杆菌、毕赤酵母等进行混合培养[30]。与藻-菌混合培养以及藻-藻混合培养相比，菌-菌混合培养的微生物之间在生长和油脂累积方面的协同作用不强，并且已有的研究主要集中在酵母和霉菌混合培养对农业废弃物的转化方面。因此，寻找更加多样的底物来源以及高产高附加值代谢产物的菌株类型，是未来值得探究的方向。

3 微生物混合培养产油的发酵底物研究现状

混合培养能够提高微生物对发酵底物的选择性和利用效率。混合培养体系中底物的碳、氮源种类和浓度以及二氧化碳水平也是影响微生物生长和油脂累积的关键因素。将酵母工业消化液用作小球藻Chlorellavulgaris与解脂耶氏酵母Yarrowialipolytica的混合培养底物，随着底物稀释倍数的增加，其生物量和油脂产量均降低[21]。刘方舟等[16]研究了不同碳源(葡萄糖、甘油和乙酸钠)在不同初始质量浓度(1～10 g/L)下普通小球藻ChlorellavulgarisUTEX2714和粘红酵母Rhodotorulaglutinis2.704共培养的生长和油脂累积的情况，结果表明，不同碳源的最适质量浓度存在差异，3种碳源的最适质量浓度分别为7、5 g/L和10 g/L，栅藻Scenedesmusobliquus与其共生细菌B1进行混合培养时，使用添加NaHCO3的BBM人工培养基培养16 d后，栅藻的生物量和油脂含量分别达到2.42 g/L和24.4%，显著高于未添加NaHCO3的对照组(1.38 g/L和22.0%)[10]。二氧化碳水平的增加能够提高微藻的光合作用速率，有利于推动混合培养体系碳的转化，进而促进微生物的生长和油脂合成。

与人工培养基相比，虽然废弃物作为发酵底物时微生物的生长相对较慢，但仍然可以获得较多的生物量和胞内油脂。微生物混合培养的研究多使用工农业废弃物、城市废水、食物垃圾等作为发酵底物，废弃物中人工营养成分的添加能够促进微生物的生长和代谢产物的累积。小球藻与酵母混合培养能够利用酿酒厂废水[17]、工厂粗甘油副产物[23]、海产品加工废水[22]、城市废水[24]、木薯蔗渣水解液[3]、食品废弃物[18,31]等进行生长和油脂合成。蛋白核小球藻Chlorellapyrenoidosa15-2070与粘红酵母Rhodotorulaglutinis(GIM2.27)在未脱毒的木薯蔗渣水解液中混合培养12 d后，两者的生物量和油脂产量分别达到31.45 g/L和18.47 g/L[3]。微生物混合培养的底物可以使用一种废弃物，也可以使用两种以上的废弃物混合液。蛋白核小球藻与圆红冬孢酵母在黄酒酿造废水和生活废水混合液中培养5 d后，油脂含量和产量分别达到63.45%和4.60 g/L[17]。藻-菌混合培养能够对多种废弃物进行高效利用，同时累积较高含量的油脂，是极具工业化应用前景的微生物组合，在废弃物资源化再利用方面具有很好的应用潜力。

此外，废弃物中添加一定比例的人工培养基成分或者碳氮源，往往更有利于微生物的快速生长和油脂累积，并且不同种类的外加碳源影响微生物的转化能力[16]。斜生四链藻Tetradesmusobliquus(ACOI 204/07)与圆红冬孢酵母RhodosporidiumtoruloidesNCYC 921以啤酒厂二次废水为发酵底物进行混合培养，底物中甘蔗糖蜜的添加促进了微生物的生长，其生物量(1.68 g/L)明显高于未添加的对照组(0.44 g/L)[13]。以乳品废水发酵液和甘油为底物，小球藻ChlorellavulgarisNIES-227与解脂耶氏酵母YarrowialipolyticaGIM 2.197混合培养144 h后，其生物量和油脂产量分别达到1.62 g/L和0.31 g/L[20]。微生物混合培养利用来源广泛、价格低廉的各种废弃物作为发酵底物，能够降低生产成本，实现资源再利用和环境保护的目的。

4 结 语

微生物混合培养生产油脂的研究主要集中在藻-菌、藻-藻和菌-菌混合培养，既可以利用富营养人工培养基，也可以发酵各种废弃物，是一种绿色、经济的油脂生产方式。藻-菌混合培养通过微藻与酵母(或细菌)之间的营养互补和化感物质作用，实现微生物的快速生长和油脂的大量累积，是目前该领域的研究热点。藻-藻混合培养可通过加强微藻之间的相互竞争，提供低氮环境促进脂质的累积。而菌-菌混合培养分别利用微生物的降解能力和油脂合成能力，提高产油微生物对大分子底物的利用效率。一方面，目前用于混合培养生产油脂的微生物种类较少，主要为小球藻、栅藻、粘红酵母、圆红冬孢酵母和酿酒酵母，未来可以进一步将高产高附加值代谢产物的微藻和原生生物等用于混合培养生产油脂的研究。另一方面，混合培养代谢产物组成简单，脂肪酸组成多为C14～C18的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，可用于生物柴油的生产原料；而针对长链多不饱和脂肪酸合成微生物的混合培养研究短缺，亟待全面深入研究。