尿素包合法富集苦瓜籽油中α-桐酸的工艺优化

帅晓艳，王惠玲，张 瑞，杨 宁，吴慕慈，叶树芯，李玉保，何静仁

(1.武汉轻工大学 硒科学与工程现代产业学院，武汉 430023； 2.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，武汉 430023； 3.运鸿集团股份有限公司，湖北 武穴 435406)

苦瓜(MomordicacharantiaL，MC)，是葫芦科(Cueurbitaeeae)苦瓜属草本植物果实，作为一种药食同源性瓜果，在我国已有上千年的栽培食用历史，其营养价值在所有葫芦科植物中排名第一[1]，具有抗肿瘤、降低胆固醇等多种生物功效[2]。苦瓜籽仁中含有多糖、皂苷等生物活性成分，其蛋白质含量高达39%～45%[3]。苦瓜籽仁中含有大量油脂，占苦瓜籽总质量的25%以上[4]。苦瓜籽油富含共轭亚麻酸(CLN)，尤其含有大量α-桐酸(CLN的一种)[5]。共轭亚麻酸是一组在C9,11,13位具有双键的十八碳三烯酸的同分异构体，其天然存在于极少数反刍动物体内和植物种子油中，且主要以甘油三酯的形式存在。近年来，许多研究表明共轭亚麻酸具有减肥[6]、抗癌[7]、抗糖尿病[8]和调节肝脂代谢[9]等多种生理功能。苦瓜籽油作为为数不多的富含α-桐酸的可食用植物油来源之一，具有良好的应用开发价值。

当前，对苦瓜及苦瓜籽中生物活性物质的分离纯化研究多集中于活性多肽、多糖和皂苷等成分，而对功能性脂肪酸分离方面的研究报道较少。脂肪酸分离纯化方法主要包括蒸馏法、尿素包合法、低温结晶法、高速逆流色谱法、脂肪酶辅助法、超临界CO2萃取法、分子蒸馏法等[10]。与其他方法相比，尿素包合法操作简单，试验条件温和，成本低且无污染。本试验以超临界CO2萃取的苦瓜籽油为原料，采用皂化酸解法制得混合脂肪酸，再利用尿素包合法对α-桐酸进行富集，分析富集前后的脂肪酸组成及含量，以期为苦瓜籽油的深度开发和综合利用研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苦瓜籽油(超临界CO2萃取所得)，运鸿集团股份有限公司提供；氢氧化钾、95%乙醇、石油醚(30～60℃)、盐酸、无水硫酸钠、尿素等，均为分析纯；甲醇、正己烷，均为色谱级，美国Fisher公司；α-桐酸标准溶液(5 mg/mL)，上海甄准生物公司。

PF-101T集热式恒温磁力搅拌器；R3旋转蒸发仪，瑞士 Buchi 公司；YR-PTB真空泵；AL204电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；PCR-B-SF-10 超纯水机；7890A-5975C气相色谱质谱联用仪，美国Agilent公司。

1.2 试验方法

1.2.1 苦瓜籽油理化指标测定

相对密度，参照GB 5009.2—2016进行测定；酸值，参照GB 5009.229—2016进行测定；碘值，参照GB/T 5532—2008进行测定；过氧化值，参照GB 5009.227—2016进行测定；皂化值，参照GB/T 5534—2008进行测定。

1.2.2 苦瓜籽油混合脂肪酸的制备

准确称取4 g左右苦瓜籽油于烧瓶中，加入0.5 mol/L氢氧化钾乙醇溶液20 mL，于70℃下磁力搅拌回流1.5 h。冷却至室温，加入2 mL蒸馏水后用石油醚萃取3次，除去溶液中的不皂化物。底层溶液用2 mol/L HCl调节pH至2～3，用石油醚萃取3次后合并有机相，用无水硫酸钠脱水，旋转蒸发除去石油醚后得到苦瓜籽油混合脂肪酸。

1.2.3 尿素包合法富集α-桐酸

参照文献[11-12]，尿素中加入一定量溶剂(95%甲醇或95%乙醇)，于75℃水浴下加热回流并磁力搅拌至尿素溶解完全，然后加入一定量苦瓜籽油混合脂肪酸，在70℃水浴下加热回流并磁力搅拌，直至溶液变为澄清透明后，室温下冷却，于一定温度下包合一定时间。包合完成后减压抽滤，滤液于40℃回收溶剂后加入2 mL蒸馏水并用2 mol/L HCl调节pH为2～3，加石油醚萃取3次，合并有机相后用温水洗至溶液呈中性，加入无水硫酸钠进行脱水，旋转蒸发回收石油醚，即得较高含量的α-桐酸(产物)。产物收率为富集后α-桐酸质量与混合脂肪酸质量的比值。

1.2.4 脂肪酸组成的测定

参照GB 5009.168—2016，采用三氟化硼法对样品进行甲酯化，然后采用GC-MS测定脂肪酸组成。GC条件：HP-88色谱柱(100 m× 0.25 mm×0.20 μm)；载气为99.999%高纯氮气，恒流模式，柱流速1 mL/min；进样量1 μL，不分流进样；进样口温度250℃；升温程序为150℃保持0 min，以4℃/min升温至190℃，保持5 min，再以2℃/min升温至230℃，保持10 min。MS条件：离子化方式EI+，电子能量70 eV，接口温度250℃，离子源温度 200℃。

质谱库为NIST11.L。采用峰面积归一化法对各脂肪酸进行定量。

1.2.5α-桐酸纯度的计算

先将1 mL 5 mg/mLα-桐酸标准品甲酯化。准确吸取1 mLα-桐酸甲酯(α-桐酸质量浓度2.5 mg/mL)于1 mL容量瓶中，作为α-桐酸甲酯标准储备液。精密量取储备液0.4、0.2、0.1、0.05、0.02 mL于1 mL容量瓶中，用正己烷定容，制得系列标准工作溶液，经GC-MS测定后，以峰面积(X)为横坐标，α-桐酸质量浓度(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得到α-桐酸的标准曲线方程为Y=1.24×10-8X+0.166 5(R2=0.995 3)。根据标准曲线方程以及样品甲酯化后经GC-MS测定获得的α-桐酸甲酯峰面积，按下式计算试样的α-桐酸纯度(Y0)。

(1)

式中：c为代入标准曲线计算所得α-桐酸质量浓度，mg/mL；V为甲酯化稀释体积，mL；m为甲酯化苦瓜籽油质量，g。

1.2.6 数据分析

试验数据采用“平均数±标准差”表示，采用Origin 9.0 作图。

2 结果与讨论

2.1 苦瓜籽油的理化指标(见表1)

表1 苦瓜籽油主要理化指标

由表1可以看出，苦瓜籽油过氧化值相对较高，这与文献[13-14]报道不一致，可能与苦瓜籽油放置时间、苦瓜种类、提取方法有关。另外，苦瓜籽油皂化值较低，可能是因为其含有较多的不皂化物。

2.2 单因素试验

2.2.1 尿素包合溶剂种类对α-桐酸富集的影响

在混合脂肪酸与尿素质量比1∶4、尿素与溶剂质量比1∶4、包合温度0℃、包合时间18 h条件下，考察溶剂(95%甲醇、95%乙醇)对α-桐酸富集效果的影响，结果如图1所示。

图1 尿素包合溶剂种类对富集效果的影响

由图1可以看出，95%甲醇、95%乙醇作为溶剂时，包合后得到的α-桐酸纯度和产物收率差别不大，考虑到95%甲醇作溶剂可能会形成甲酯，甲酯具有一定的毒性[15]，影响α-桐酸后续在保健品等方面的应用。因此，选择95%乙醇作溶剂。

2.2.2 尿素与溶剂质量比对α-桐酸富集的影响

在95%乙醇作溶剂、混合脂肪酸与尿素质量比1∶4、包合温度0℃、包合时间18 h条件下，考察尿素与乙醇质量比对α-桐酸富集效果的影响，结果如图2所示。

由图2可以看出，α-桐酸纯度和产物收率随着乙醇用量的增加均有较大幅度的提高，α-桐酸纯度由29.67%提高到44.21%，产物收率由12.94%提高到26.92%。这是因为乙醇用量的增加会降低混合脂肪酸的浓度，尿素分子可以与脂肪酸充分接触，单不饱和脂肪酸更容易被尿素包合。此外，受乙醇用量增加的影响，混合脂肪酸的黏度逐渐降低，进一步减少了过滤过程中尿素包合晶体对多不饱和脂肪酸的吸附，从而使得滤液中α-桐酸的纯度提高。在尿素与乙醇质量比为1∶5时，尿素分子的包合能力即将达到极限，α-桐酸纯度和产物收率增加都趋于平缓。因此，选择尿素与乙醇质量比为1∶5。

图2 尿素与乙醇质量比对富集效果的影响

2.2.3 混合脂肪酸与尿素质量比对α-桐酸富集的影响

在95%乙醇作溶剂、尿素与乙醇质量比1∶5、包合温度0℃、包合时间18 h条件下，考察混合脂肪酸与尿素质量比对α-桐酸富集效果的影响，结果如图3所示。

图3 混合脂肪酸与尿素质量比对富集效果的影响

由图3可以看出：随着混合脂肪酸与尿素质量比的增加，α-桐酸的纯度逐渐提高，由35.60%提高到50.20%；而产物收率随混合脂肪酸与尿素质量比的增加从22.66%降低到12.15%。这可能是因为当尿素用量较低时，各脂肪酸之间会相互竞争，尿素无法将单不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸完全包合，因此在滤液中残留较多未被包合的单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸，使得α-桐酸的纯度不高而产物收率较高。但是尿素包合脂肪酸的能力是一定的，尿素用量过多时，剩余的尿素就会与部分多不饱和脂肪酸进行包合，从而导致产物收率降低。此外，多不饱和脂肪酸和尿素分子均具有较强的极性，彼此之间存在相互吸附作用，并能形成氢键，在过滤过程中部分多不饱和脂肪酸仍能被尿素吸附。因此，选择混合脂肪酸与尿素质量比为1∶4。

2.2.4 包合时间对α-桐酸富集的影响

在95%乙醇作溶剂、尿素与乙醇质量比1∶5、混合脂肪酸与尿素质量比1∶4、包合温度0℃条件下，考察包合时间对α-桐酸富集效果的影响，结果如图4所示。

图4 包合时间对富集效果的影响

由图4可以看出，随着包合时间的延长，α-桐酸纯度先增加后趋于平缓，同时产物收率随着包合时间的延长而减少。这可能是由于在较短的包合时间内，尿素晶粒生长受到影响，随着包合时间的延长，尿素与饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的包合更加充分，从而使得α-桐酸纯度逐渐提高。然而当尿素的晶粒长到一定限度时，继续包合会导致尿素对多不饱和脂肪酸的包合，从而降低产物收率。因此，选择包合时间为18 h。

2.2.5 包合温度对α-桐酸富集的影响

在95%乙醇作溶剂、尿素与乙醇质量比1∶5、混合脂肪酸与尿素质量比1∶4、包合时间18 h条件下，考察包合温度对α-桐酸富集效果的影响，结果如图5所示。

图5 包合温度对富集效果的影响

由图5可以看出：随包合温度的升高，α-桐酸纯度呈下降趋势，这是因为尿素包合过程是一个放热的过程，较低的温度能够促进包合物生成，提高产物纯度[16]；但是在包合温度过低时，尿素与脂肪酸包合速率过快，反应体系在未包合完全的情况下就已经凝结，使得后期过滤困难，导致产物收率偏低，随着包合温度的升高，多不饱和脂肪酸在乙醇中的溶解度提高，使产物收率升高。然而包合温度升高，脂肪酸与尿素的结合并不稳固，包合物晶体之间分布较为松散，饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸很容易与尿素脱离，从而使α-桐酸纯度下降。包合温度为0℃时，α-桐酸纯度和产物收率都较高。因此，选择包合温度为0℃。

2.3 正交试验

在单因素试验基础上，固定95%乙醇作为尿素溶剂，尿素与乙醇质量比1∶5，以混合脂肪酸与尿素质量比、包合时间、包合温度为因素，α-桐酸纯度为指标，设计三因素三水平的正交试验优化α-桐酸富集工艺。正交试验因素水平见表2，正交试验设计及结果见表3。

表2 正交试验因素水平

表3 正交试验设计及结果

由表3可以看出，各因素对α-桐酸富集的影响主次顺序为A>C>B，即混合脂肪酸与尿素质量比的影响最大，其次是包合温度、包合时间。最佳工艺组合为A1B3C3，即选择95%乙醇为尿素溶剂，尿素与乙醇质量比1∶5，混合脂肪酸与尿素质量比1∶3，包合温度4℃，包合时间24 h。在最佳条件下，α-桐酸纯度为60.03%，产物收率为33.94%。

2.4 尿素包合前后脂肪酸组成(见表4)

由表4可知：苦瓜籽油中共检出8种脂肪酸，与张飞等[14]的研究结果相似；饱和脂肪酸有3种，不饱和脂肪酸有5种，其中共轭亚麻酸包括α-桐酸及其两种顺反异构体CLN-B、CLN-C，与文献[14,17-18]所测的苦瓜籽油含有高不饱和脂肪酸结果相同。富集前苦瓜籽油中主要的脂肪酸是硬脂酸和α-桐酸，相对含量分别为37.64%、32.97%，富集后，硬脂酸相对含量减少至16.10%，而α-桐酸相对含量增加至53.94%，此时α-桐酸纯度为60.03%，较苦瓜籽油中的28.83%显著提高；共轭亚麻酸相对含量达到71.28%，比富集前增加了19.65百分点。因此，尿素包合法可用于富集苦瓜籽油中的α-桐酸。

表4 α-桐酸富集前后脂肪酸组成及相对含量 %

3 结 论

以超临界CO2萃取的苦瓜籽油为原料，采用尿素包合法富集苦瓜籽油中的α-桐酸。通过单因素试验和正交试验，确定最佳富集工艺条件为：以95%乙醇为尿素溶剂，苦瓜籽油混合脂肪酸与尿素质量比1∶3，尿素与乙醇质量比1∶5，包合温度4℃，包合时间24 h。在最佳条件下，α-桐酸纯度为60.03%，产物收率为33.94%，α-桐酸相对含量为53.94%，共轭亚麻酸相对含量达到71.28%。