小鼠嗜酸粒细胞性慢性鼻-鼻窦炎模型的建立

卫红齐，陈 伟，徐夏媛，刘志勇，莫江伟，邢洪瑜，曹忠胜

0 引 言

嗜酸粒细胞性慢性鼻-鼻窦炎(eosinophilic chronic rhinosinusitis, ECRS)作为慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps, CRSwNP)的一个亚型，是一种高度异质性鼻腔鼻窦黏膜慢性炎性疾病，近年发病率有上升趋势，严重影响患者生活质量[1]。研究发现，ECRS除鼻-鼻窦黏膜组织中有大量嗜酸性粒细胞(eosinophil，EOS)浸润以外，通常伴有广泛息肉形成，且以2型T辅助细胞(type-2 T helper cell，Th2)反应为主，虽对糖皮质激素治疗敏感，然在停用糖皮质激素后难以维持长期疗效，即使手术治疗，黏膜炎症也难以控制，且术后复发率较高[2-3]。因此，探究ECRS发病机制并寻求好的治疗方案具有重要临床意义，故建立一个理想动物模型进行相关研究倍受关注。而目前截止投稿国内有关ECRS动物模型的建立方法未见报道。本研究采用普通抗原卵清蛋白(ovalbumin，OVA)联合超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)来建立小鼠ECRS实验模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂SPF级雌性BALB/c小鼠24只 ，4～6周龄，体重20～30g，购自上海千全生物科技有限公司，常规方法饲养于我院实验中心SPF级动物房内，动物实验许可证号：SYXK(苏)2016-0050。适应性饲养2周，温度22～24℃，湿度50%，正常饮食。

OVA(编号：A5503-10G)购自美国Sigma公司，SEB(编号：BT202)购自美国Toxin Technology 公司，氢氧化铝粉剂(编号：77161)购自美国Thermo公司，小鼠 IFN-γ(编号：EK280/3-96)、IL-4(编号：EK204/2-96)、IL-5(编号：EK205-96)、IL-17A(编号：EK217/2-96)细胞因子特异性ELISA试剂盒购自杭州联科生物科技有限公司。免疫组化试剂：一抗为抗嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(Eosinophil cationic protein，ECP)兔单克隆抗体(编号：ab207429)，二抗为生物素结合的山羊抗兔lgG(编号：ab205718)，均购自英国Abcam公司。

1.2ECRS模型的建立方法将24只BALB/c雌性小鼠随机分为4组，分别为：磷酸缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline，PBS)组、SEB组、OVA组及SEB+OVA组，每组6只。建模方法参照Kim等[4]所采用的方法并进行适当改变。用腹腔注射OVA以及鼻腔滴入OVA使小鼠致敏，后通过鼻腔滴入SEB以及OVA的方法诱导小鼠ECRS。PBS组：第0天(d0)和第5天(d5)经腹腔注射0.2 mL PBS溶液；从d12开始，连续7d每天予40 μL PBS溶液滴鼻；从d19至d102共12周，每周3次予40 μL PBS溶液滴鼻。SEB组小鼠前46天与PBS组小鼠处理方法相同，从d47开始连续8周用10 ng SEB，每周一次鼻腔滴注。OVA及SEB+OVA两组小鼠：d0和d5腹腔注射0.2 mL含25 μg OVA及2mg氢氧化铝的混悬液(PBS稀释)；从d12开始，连续7天每天予40 μL 3%OVA溶液滴鼻；从d19至d102共12周，每周3次予40 μL 3%OVA溶液滴鼻。SEB+OVA组从d47开始除了鼻腔滴注3%OVA溶液以外，连续8周给予10 ng SEB，每周一次滴鼻。每天观察动物饮食、精神状况以及鼻部症状。在d103获取标本进行检测分析。

1.3ECRS模型检测

1.3.1 细胞因子表达水平小鼠用7%水合氯醛(0.05 mL/10 g)腹腔注射麻醉后固定，仰卧头低位进行鼻腔灌洗(头低位防止灌洗液流入下呼吸道)。一侧鼻腔以5滴/min(平均一滴约0.05 mL) 的速度缓慢滴入等渗盐水，同时在对侧鼻腔用低负压持续抽吸收集鼻腔灌洗液(nasal lavage fluid, NLF)(此法有60%～80%回收率)。共收集NLF约2 mL，室温静止沉淀30 min，4 ℃离心10 min，4000 r/min，离心半径6 cm，取其上清液-70 ℃保存待测。所有上清液标本收集完毕后，用ELISA，按照试剂盒操作步骤检测NLF中的IFN-γ、IL-4、IL-5及IL-17A的浓度。

1.3.2组织病理学观察NLF收集完后，颈椎脱臼法处死小鼠，去除头部皮肤及皮下软组织，断头后整体放福尔马林固定48h后用10% EDTA脱钙液脱钙5周，每3天更换一次脱钙液。后经脱水、包埋制作蜡块, 切片(片厚4μm)后用HE染色，在光镜下观察各组小鼠鼻-鼻窦黏膜组织病理学改变。主要观察鼻-鼻窦有无息肉样病变以及黏膜组织中EOS浸润情况，并在高倍视野(400倍)下对息肉样病变以及EOS进行计数。息肉样病变定义为有明显的黏膜隆起伴EOS浸润。观察结果用息肉样病变计数/只以及EOS计数/HPF来表示。

1.3.3免疫组化染色用免疫组织化学染色检测鼻-鼻窦黏膜组织中ECP表达水平。4μm厚切片在二甲苯中脱蜡后用乙醇水化，PBS冲洗3次，用1%的正常山羊血清封闭切片，然后滴加一抗，为抗ECP兔单克隆抗体，在4℃的加湿环境下过夜。切片用PBS冲洗3次，然后滴加二抗，为生物素结合的山羊抗兔lgG(1∶1200)，在室温下孵育90 min。随后，切片在室温下与生物素标记的辣根过氧化物酶复合物(avidin-biotinylated horseradish peroxidase complex, ABC)孵育60min，PBS冲洗，用二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色处理。最后，切片用苏木素衬染，中性树胶封片，光镜下观察。每张切片均由两名未知动物分组的病理科医师独立观察并分析。

结果判定：ECP主要表达于EOS的细胞核内，以细胞核染成棕黄色和(或)棕褐色为阳性细胞。每只小鼠取染色良好切片3张，每张切片于400倍视野下任意取不相重叠的黏膜组织5处进行观测，对表达ECP的阳性细胞均数进行统计分析。

2 结 果

2.1 细胞因子水平OVA组、SEB+OVA组IL-4和IL-5浓度显著高于PBS组、SEB组(P<0.05)；SEB+OVA组IL-5表达水平较OVA组显著升高(P<0.05)。见表1。

表 1 小鼠NLF中IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-17A浓度比较

2.2鼻-鼻窦黏膜组织病理学改变

2.2.1 EOS浸润PBS组小鼠鼻-鼻窦黏膜上皮完整，未见明显炎性细胞浸润；SEB组小鼠鼻-鼻窦黏膜内及黏膜下可见散在炎性细胞浸润；OVA组小鼠鼻-鼻窦黏膜水肿增厚伴有EOS浸润；SEB+OVA组小鼠鼻-鼻窦黏膜组织中见大量炎性细胞浸润，尤以EOS及淋巴细胞最显著。见图1。OVA组EOS计数[(35.56±5.24)/HPF]显著高于PBS组[(0.56±0.29)/HPF]、SEB组[(1.83±0.64)/HPF)](P<0.05)；SEB+OVA组EOS计数[(77.80±10.29)/HPF]显著高于PBS组、SEB组及OVA组(P<0.05)。

a：PBS组； b：SEB组； c：OVA组； d：SEB+OVA组图示SEB+OVA组见大量EOS浸润图 1 鼻-鼻窦黏膜组织中EOS浸润(HE ×400)Figure 1 Eosinophilic infiltration were observed in the sinonasal mucosa(HE ×400)

2.2.2息肉样病变PBS组、SEB组及OVA组鼻-鼻窦黏膜均未见息肉样病变。SEB+OVA组每只小鼠鼻-鼻窦黏膜均可见息肉样病变，个数1至4，共观察到14个息肉样病变；息肉样病变的组织病理主要表现为黏膜肿胀隆起(细胞间隙水肿)伴EOS浸润，见图2。SEB+OVA组息肉样病变计数[(2.33±0.94)个/只]较其他组(0±0)明显升高(P<0.05)。

图示鼻-鼻窦黏膜肿胀隆起伴EOS浸润

2.3鼻-鼻窦黏膜组织中ECP表达免疫组化染色显示，OVA组、SEB+OVA组鼻-鼻窦黏膜组织中均有较强表达ECP的阳性信号，表达ECP阳性细胞数[(16.53±4.82)/HPF、(34.60±7.25)/HPF)]显著多于PBS组[(0.49±0.18)/HPF]、SEB组[(0.74±0.26)/HPF]，差异具有统计学意义(P<0.05)，且SEB+OVA组表达ECP的阳性细胞数多于OVA组(P<0.05)。见图3。

a：PBS组； b：SEB组； c：OVA组； d：SEB+OVA组

3 讨 论

2011年，Kim等[4]首次报道使用低剂量的SEB在小鼠变应性鼻-鼻窦炎基础上成功诱导鼻息肉样病变伴EOS浸润，与ECRS病理改变相似。之后该学者在该模型基础上进行拓展研究[5]。本实验参照Kim报道的方法，根据预实验的研究进行适当改变，即在OVA致敏的基础上适当增加鼻腔滴入SEB剂量，成功诱导ECRS，研究结果基本一致。

Th2反应是ECRS重要免疫学特征。OVA组及SEB+OVA组Th2细胞因子(IL-4和IL-5)高表达，且SEB+OVA组IL-5表达水平较OVA组更高，表明OVA作为普通抗原可诱导鼻-鼻窦黏膜Th2型免疫反应，OVA联合SEB诱导Th2反应更强烈。IL-5是促进EOS在气道黏膜粘附、募集和脱颗粒的关键细胞因子[6-7]。IL-5的高表达可能在OVA联合SEB诱导ECRS过程中起重要作用。

ECRS主要病理特征：一是组织中大量EOS浸润；二是鼻腔和(或)鼻窦有息肉样病变。SEB+OVA组小鼠鼻-鼻窦黏膜组织中有大量EOS浸润，且可见息肉样病变，按照EPOS2020[8]提出的每HPF≥10个EOS作为ECRS诊断标准，EOS计数远多于此标准所规定的计数。虽然OVA组也有明显EOS浸润，但EOS计数明显少于SEB+OVA组，且未见息肉样病变，因此单纯滴入OVA可诱导变应性鼻-鼻窦炎，但炎症的程度还不足以诱导息肉样病变。小鼠鼻腔单纯滴入SEB鼻-鼻窦黏膜组织形态学改变不显著，具体原因值得探究。SEB作为超抗原在CRSwNP发生发展中的作用已得到证实。Braga等[9]单独使用SEB可成功诱导兔ECRS。本研究前期结果也显示，单独向兔上颌窦腔注入高浓度SEB可诱导急性上颌窦炎[10]。本实验单独使用SEB不能诱导鼻-鼻窦黏膜炎性改变的可能与诱导方式以及动物种类不同有关。国外有学者通过小鼠哮喘模型研究发现，SEB增强气道高反应以及变应性炎症反应需要在OVA致敏的小鼠体内[11]。

ECP主要来源于活化的EOS脱颗粒。研究发现，鼻腔分泌物中ECP表达水平与EOS计数存在显著相关性，鼻腔分泌物中ECP升高可能源于EOS脱颗粒水平上调[12-13]。本实验中，SEB+OVA组鼻-鼻窦黏膜组织中ECP表达水平显著升高，可能与EOS大量表达有关。ECP可通过损伤鼻-鼻窦黏膜上皮细胞膜导致细胞坏死脱落，且与多种细胞因子、趋化因子和黏附分子等相互作用，在鼻部慢性炎性疾病发展中起重要作用[14]。

本实验结果与Kim等[4]研究结果比较，鼻-鼻窦黏膜组织病理学改变虽然相似，但本研究在诱导ECRS过程中使用的SEB剂量是10ng，而Kim使用的剂量是5ng。本实验选择10ng的原因：①在前期的预实验中我们按照SEB 5ng进行诱导，小鼠鼻-鼻窦黏膜组织病理学观察未见明显息肉样病变；②近几年，有国外学者尝试用SEB 10ng而非5ng来诱导ECRS进行相关研究[15-16]。本研究使用SEB 5ng不能诱导小鼠鼻息肉样病变的可能原因：① 小鼠鼻孔太小，SEB滴入过程中未能全部进入小鼠鼻腔鼻窦；② 小鼠体位放置不当，滴入的SEB很快从前鼻孔溢出或流至鼻咽部。上述因素导致SEB在鼻腔鼻窦停留时间太短，实际有效剂量不足。我们推测，如果每次5ng SEB全部进入鼻腔鼻窦发挥作用，剂量可能足以诱导ECRS，通过后续研究进一步证实。

OVA联合SEB诱导小鼠ECRS，该模型在免疫学上呈现Th2型免疫反应，在组织病理学上表现为嗜酸性炎症反应，与人类ECRS具有相似性。然而，该模型也有一些局限性[4-5]。首先，小鼠鼻腔鼻窦气动窦结构空间相对较小，进行影像学评估相对困难。第二，小鼠嗅区黏膜上皮占据鼻腔黏膜上皮大部分区域，与人类存在一定差异。第三，小鼠鼻息肉样病变的外观形态与人鼻息肉外观形态差异明显。最后，该模型是由抗原及细菌毒素驱动的，所以它不能代表所有ECRS的诱导因素。所以，将动物实验数据转化并用于探索人类疾病也需慎重考虑，故对ECRS最佳动物模型探索仍存在挑战。