N 6-甲基腺苷甲基化修饰与结直肠癌关系的研究进展△

韩非，程海东，侯明星#

1内蒙古医科大学第一临床医学院，呼和浩特 010010

2内蒙古医科大学附属医院胃肠外科，呼和浩特 010010

结直肠癌是成年人最常见的恶性肿瘤之一，发病率居全球恶性肿瘤第三位，仅次于乳腺癌及肺癌，病死率高居第二位[1]。结直肠癌的治疗方式主要包括手术、新辅助放化疗、靶向治疗和免疫治疗，即使经过积极的治疗，晚期结直肠癌的治疗效果仍然不令人满意[2]。结直肠癌的发生、发展是一个复杂的过程，涉及遗传学、表观遗传学和转录组学的变化。越来越多证据表明，N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）调节因子的失调与结直肠细胞癌变和进展相关。因此，进一步阐明结直肠癌的分子发病机制，以早期发现及诊断对疾病的治疗是必要的。本文对m6A修饰在结直肠癌中的研究进展进行综述，旨在对结直肠癌的发病机制进一步阐明，从表观遗传修饰的角度为结直肠癌的早期诊断及靶向治疗提供新思路。

1 m6A甲基化的概念及其调节因子

表观遗传修饰是指在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能可逆的、可遗传的改变，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA修饰。前两者的研究已较为成熟，RNA修饰尽管发现的较早，但由于技术的限制，近十年来才成为研究热点。目前已有100多种RNA修饰被报道，其中m6A修饰是真核生物mRNA中最常见的内部修饰[3]。m6A修饰受甲基转移酶、去甲基化酶和甲基化识别蛋白调控[4]。甲基转移酶复合体由甲基转移酶3（methyltransferase 3，METTL3）、甲基转移酶 14（methyltransferase 14，METTL14）、WT1相关蛋白（WT1 associated protein，WTAP）、病毒样m6A甲基相关转移酶（vir like m6A methyltransferase associated，VIRMA）、锌指CCCH结构域蛋白13（zinc finger CCCH-type containing 13，ZC3H13）和 RNA结合基序蛋白15（RNA binding motif protein 15，RBM15）组成，可使RNA上的碱基发生m6A甲基化修饰[5]。m6A去甲基化由肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）和烷基 B同系物5（alkB homolog 5，ALKBH5）两种去甲基酶催化。含有YTH同源结构域的蛋白、胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1/2/3（insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 1/2/3，IGF2BP1/2/3）和异质性核糖核蛋白A2/B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，HNRNPA2B1）是 m6A 的“识别蛋白”，发挥促进m6A修饰的RNA剪接、翻译、转运、调节稳定性等作用[6]。m6A修饰在甲基化酶和去甲基化酶的作用下，对RNA的调控是动态可逆的过程，这种修饰的失调与包括恶性肿瘤在内的人类疾病密切相关。研究表明，在肝癌、胃癌、急性髓系白血病等肿瘤中，m6A调节因子的异常表达在肿瘤的发生、增殖及影响患者预后中都有着重要作用[7-9]。

2 m6A修饰在结直肠癌中的研究进展

2.1 METTL 3

METTL3是m6A甲基转移酶中的重要亚单位，催化甲基从S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）转移到目标mRNA腺嘌呤的N原子上，实现m6A甲基化[10]。METTL3促进肠癌细胞的增殖与糖酵解有着密切关系，从机制上有以下两种方式：一是通过稳定大肠癌细胞中己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）和葡萄糖转运蛋白1（recombinant glucose transporter 1，GLUT1）的mRNA水平而发挥致癌基因的作用[11]；二是通过影响GLUT1介导的葡萄糖代谢途径激活雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信号通路，加强了肠癌细胞的增殖能力[12]。METTL3对肠道肿瘤增殖的影响不仅仅在糖代谢途径中体现，作用于MYC原癌基因（MYC proto-oncogene，MYC）也是其中重要的环节。MYC作为较早发现的一类基因，被证实在多种人类肿瘤中过表达。上调的METTL3通过增强MYC的表达促进大肠癌细胞的增殖和肿瘤的发生[13]，在此过程中，MYC受METTL3/IGF2BP2 轴的调控[14]。此外，Zhu 等[15]发现METTL3的高表达可通过稳定细胞周期蛋白E1（cyclin E1，CCNE1）mRNA的表达促进结肠癌细胞的增殖。

METTL3促进肿瘤的发展还体现在它能提高肿瘤细胞的转移能力，其中miRNA-1246/与EVH1结构域2相关的sprouty蛋白（sprouty related EVH1 domain containing 2，SPRED2）轴是METTL3发挥作用的重要信号通路[16]。METTL3介导的miRNA-1246上调负向调节SPRED2的表达，而SPRED2作为调节生长因子发挥抑癌基因的作用。作为主要的m6A编写者，METTL3表达水平增高还可以抑制细胞因子信号2（suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2）mRNA的表达，以维持结肠癌细胞中富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体 5（leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5，LGR5）表达水平，从而增强肠癌细胞的转移能力[17]。由此可见METTL3可通过对RNA的不同作用维持肠癌细胞生长、增殖及转移的肿瘤学特性。

2.2 METTL14

METTL14作为甲基转移酶复合体的中心成分，已被证实其表达失调参与多种恶性肿瘤的发生和发展。与METTL3不同的是，多种研究表明，结直肠癌组织中METTL14表达明显下调，METTL14更多的是作为抑癌基因调控肠癌的进展。METTL14在结直肠癌中调节RNA表达主要包括信使RNA、非编码RNA以及miRNA。在信使RNA调节中，METTL14可以通过抑制癌基因转录，提高抑癌基因稳定性，抑制结直肠癌发展。SRY-盒转录因子4（SRY-box transcription factor 4，SOX4）是METTL4的下游靶基因，METTL14通过抑制SOX4基因参与的上皮-间充质转化过程，降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力[18]。另一方面，METTL14/IGF2BP2/Kruppel样因子 4（Kruppel like factor 4，KLF4）轴可以增加抑癌基因KLF4mRNA的稳定性进而抑制肠癌细胞转移[19]。

m6A甲基化修饰不仅可以作用于信使RNA，非编码RNA也是其作用靶点。X染色体失活特异性转录物（X inactive specific transcript，XIST）作为一种新发现的长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA），在多种人体肿瘤中起致癌基因作用。在结直肠癌中，lncRNA XIST被确定为METTL14的下游靶点，一旦METTL14被敲除，XIST的m6A修饰水平被消除，XIST的表达增强。初步研究表明，METTL14可以通过下调致癌的lncRNA XIST来抑制大肠癌的增殖和转移[20]。同样，微小RNA的表达调控中也发现了METTL14的踪影，METTL14通过miRNA-375/Yes相关蛋白1（Yes1 associated transcriptional regulator，YAP1）途径抑制大肠癌细胞的生长，同时通过miRNA-375/Sp1转录因子（Sp1 transcription factor，SP1）途径抑制大肠癌细胞的迁移和侵袭[21]。

此外，在细胞免疫方面，METTL14的研究也有了新进展。在肿瘤相关巨噬细胞（tumour-associated macrophage，TAM）中存在一类亚群C1q+TAM，其功能受METTL14/YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白2（YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 2，YTHDF2）轴的调节。C1q+TAM中METTL14缺乏可以抑制效应性CD8+T细胞的活化而促使CD8+T细胞功能失调最终导致机体清除肿瘤的能力受损。从机制上看，METTL14缺失的C1q+TAM细胞因子亚单位EB病毒诱导蛋白3（Epstein-Barr virus induced 3，EBI3）的m6A修饰水平降低，转录水平升高，诱导CD8+T细胞功能失调[22]。上述研究揭示了METTL4介导的不同途径在大肠癌中的作用机制。

2.3 m6A识别蛋白

YTH家族包括YTHDF1/2/3、YTH结构域包含蛋白 1/2（YTH domain containing 1/2，YTHDC1/2），属于m6A识别蛋白，能够识别特定基序上的m6A修饰，控制修饰后的RNA加速降解、翻译过程，提高稳定性等生物功能。

YTHDF1在结直肠癌中高表达，且其高表达与多种临床特征相关，如肿瘤浸润深度、淋巴结转移、病理分期等。YTHDF1作为识别蛋白可以促进m6A修饰的frizzled类受体9（frizzled class receptor 9，FZD9）和 Wnt家族成员 6（Wnt family member 6，WNT6）mRNA的翻译，导致其下游信号通路异常激活，该信号通路在肠癌细胞增殖、侵袭和转移中都发挥了至关重要的作用[23]。对YTHDF1基因上游调控基因的研究发现，c-myc与其相关，通过基因敲除实验证实，c-myc通过一种途径诱导YTHDF1激活引起致癌效应[24]。

YTHDF3也被人们发现在结直肠癌中起到致癌基因的作用，YTHDF3与lncRNA生长抑制特异因子5（growth arrest specific 5，GAS5）及 YAP 形成环路相互调节，YTHDF3的异常高表达促进lncRNA GAS5降解最终导致肠癌的发生发展[25]。此外，Tanabe等[26]发现另一种m6A识别蛋白YTHDC2可增强缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）翻译表达，进而促进上皮-间充质转化，在结直肠癌的转移中发挥重要作用。

IGF2BP家族也属于m6A识别蛋白，并且发现它与已知的YTH结构域蛋白有着截然不同的功能。IGF2BP3通过诱导加快细胞周期来提高肠癌细胞在体内外的增殖能力[27]，也可以诱导肠癌组织血管生成促使肠癌细胞转移。从机制上看，一方面，IGF2BP3可以通过减缓G1/S期细胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）mRNA的降解提高细胞周期中S期细胞百分比，达到促进肿瘤细胞增殖的目的[28]；另一方面，IGF2BP3通过与血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的mRNA结合，调节VEGFmRNA的表达和稳定性从而促进肠癌细胞的侵袭转移。

另一个IGF2BP家族成员IGF2BP2被发现与YAP和erb-b2受体酪氨酸激酶2（erb-b2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2）之间存在相互调节的关系。在该研究尚未发现之前，YAP通过调控细胞周期相关途径促进了肿瘤细胞异常增殖的结论已经达成共识。此研究发现IGF2BP2可以通过识别YAPmRNA来激活ERBB2的表达，从而调控肠癌细胞的细胞周期，促进其异常增殖[29]。此外，IGF2BP2与lncRNA结合形成复合物，该复合物能与高迁移率族蛋 白 1（high mobility group AT-hook 1，HMGA1）mRNA结合以增强HMGA1mRNA的稳定性[30]，进而促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

2.4 m6A去甲基化酶

FTO作为去甲基化酶可以将m6A脱甲基生成N6-羟甲基腺苷和N6-甲酰腺苷。有研究提出，FTO中的单核苷酸多态性可能与脂肪因子相互作用，从而提高结直肠癌的发生风险[31]。在肠癌细胞中，FTO通过阻断MYC基因m6A的修饰来提高MYC的表达，增强肠癌细胞的增殖和迁移功能。FTO自身的表达受AMP活化蛋白激酶α2（adenosine monophosphate-activated protein kinase alpha 2，AMPKα2）的调控。AMPKα2通过下调肿瘤细胞代谢阻碍肠癌细胞的增殖，能够靶向作用于FTO并抑制其表达。FTO通过参与AMPKα2/FTO/m6A/MYC轴促进肿瘤发生[32]。ALKBH5是第二种已鉴定的m6A去甲基化酶，是一种FTO同系物，可以将m6A直接氧化成腺苷。据报道，ALKBH5的缺失使肿瘤对肿瘤免疫疗法敏感，该基因敲除显著抑制了肿瘤生长并提高免疫治疗期间小鼠的存活率，并通过实验证实ALKBH5的抑制剂可增强抗程序性死亡受体 1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）疗法的功效[33]。

以上m6A调节因子在结直肠癌中的作用有多方面，在此进行总结，详见表1。

表1 m6A调节因子在结直肠癌中的作用

3 小结和展望

m6A调节因子在结直肠癌中发挥着致癌基因或者抑癌基因的作用，其失调通过介导下游靶基因表达异常在肿瘤发生、发展中扮演着至关重要的角色。尽管对于结直肠癌患者的治疗已经有了较大的进展，但是早发现、早治疗以及提高患者远期疗效都是永恒不变的话题。在治疗方面，抑制部分m6A调节因子能增强结直肠癌对PD-1/程序性死亡受体配体 1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）肿瘤免疫疗法的反应[34]，这为后续靶向药物的研究提供了新的理论依据。此外，还发现MYC基因在m6A修饰中出现频率较高，涉及酶类较多，这或许为未来对结直肠癌的诊治提供一种新的治疗策略。将m6A修饰的研究转换为临床应用仍有很长的路要走，但这并不妨碍m6A修饰在结直肠癌的诊断和治疗上有着极好的应用前景。