秋葵总黄酮通过抑制炎症反应对糖尿病小鼠的心脏保护作用

张梦宇，于万德

0 引 言

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)发生于糖尿病患者，引起心脏血管损害、心肌的代谢紊乱以及心肌纤维化，导致左心室肥厚、舒张和(或)收缩功能受损，最终进展成心力衰竭[1-2]。糖尿病的心肌损伤可能从最初的高糖状态下已开始出现,并持续整个疾病的发展，发病机制尚未完全清楚，可能与糖脂代谢异常、氧化应激、交感激活、微循环障碍、心肌纤维化、自主神经受损有关[3-4]，其中氧化应激及炎症反应是主要机制之一[5-7]。氧化应激是炎症的主要促使因素，既往的研究证实高糖状态诱导释放大量的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS),激活核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，随之启动肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)等炎症因子转录，导致血管内皮细胞损伤以及平滑肌细胞增殖，造成心肌损伤，促进糖尿病心肌病的发生[8-9]。TNF-α的抑制降低心肌纤维化，改善心脏功能。抑制NF-κB的表达可以控制促炎因子的表达，从而改善心脏功能。

黄秋葵(okra，Abelmoschus esculentus)含有独特的多糖、黄酮等生物学活性成分，具有多种重要的药用保健价值。黄秋葵多糖具有降低血糖、抗氧化及抗炎症、抑制肿瘤、改善肠道菌群环境等作用[10-12]；黄秋葵的黄酮含量较高，易溶于乙醇而难溶于水[13]，在抗氧化及清除自由基方面具有显著的作用，秋葵黄酮中的槲皮素与脂质过氧化基(ROO)反应，抑制脂质过氧化[14]。既往有关总黄酮的研究肯定了总黄酮在治疗糖尿病及其并发症方面的作用[15]，但国内外鲜有相关资料研究黄秋葵对糖尿病心肌病的治疗作用及具体机制。

1 材料与方法

1.1 黄秋葵总黄酮的来源及剂量秋葵果实产于江苏省海安市，经南京师范大学食品与制药工程学院鉴定为锦葵科秋葵属黄秋葵，并提供黄秋葵总黄酮(TFA)的提取及鉴定。根据以往文献证实的秋葵总黄酮足以产生抗氧化作用的相关剂量，本研究选择了300 mg/kg TFA喂食小鼠，选择1 μg/mL浓度的TFA预处理心肌细胞[16-17]。

1.2动物实验方法C57BL/6J小鼠，4周龄，清洁级，雄性，由南京医科大学第三临床医学院购买，实验动物合格证号：SCXK(浙)2019-0002。饲养环境：温度20 ℃，湿度50%，屏蔽环境。本实验采用高脂饲料(成分：15%猪大油，5%糖，1%胆固醇，25%胆盐，5%蛋黄粉，49%基础饲料)联合单次链脲佐菌素(STZ)腹腔诱导的糖尿病小鼠模型(HFD+STZ)。将40只C57BL/6J小鼠(4周龄)按完全随机化分组法分成4组，每组各10只。对照组：普通饲料喂养4周后，腹腔注射等量的柠檬酸缓冲液，后再予普通饲料喂养16周。TFA组：普通饲料喂养4周后，每天称重后通过经口管饲法(胃管插入深度约3 cm)喂食秋葵总黄酮300 mg/kg，并普通饲料喂养16周。糖尿病心肌病组(STZ组)：高脂饲料喂养4周后，予禁食不禁水约12 h，称重后以100 mg/kg STZ腹腔注射1次，造模后持续高脂饲料喂养16周。造模1周后禁食不禁水12 h后称重，用血糖仪测量鼠尾静脉血空腹血糖值(FBG)，FBG>13.9 mmol/L判断为糖尿病小鼠造模成功。糖尿病心肌病+TFA组(STZ+TFA组)：高脂饲料喂养4周后，予禁食不禁水约12 h，称重后以100 mg/kg STZ腹腔注射1次，造模后每天称重后通过经口管饲法喂食秋葵总黄酮300 mg/kg，并持续高脂饲料喂养16周。

所有小鼠于第0、造模16周时被送到南京医科大学动物实验中心利用小动物超声Vevo 2100(Visual Sonics)进行超声心动图检查评估左心室大小及功能。测量左室舒张末直径 (LVIDd)、左室收缩末期直径(LVIDs)、二尖瓣E峰与A峰之比(E/A)，Simpson法估测左室舒张末容积(LVEDV)、左室收缩末容积(LVESV)。运用公式计算左室射血分数(LVEF%)以及左室短轴缩短率(LVFS%)，取3次测量的平均值。公式如下：

LVEF=[(LVEDV-LVESV)/LVEDV]×100%

LVFS =[(LVIDd-LVIDs)/LVIDd]×100%

所有小鼠于第16周禁食不禁水约12 h后称量小鼠体重，取鼠尾静脉血用血糖仪测量空腹血糖值。摘眼球取血离心得到血清，自动化学分析仪(日本HITACHI7100)测量生化指标。心脏重量/体重比(HW/BW)：计算公式称量小鼠的心脏重量与体重的比值。

应用HE染色及Masson染色比较心肌形态及纤维化，Western blot检测心肌蛋白p65及心肌核蛋白NF-κB、p65的表达水平。采用Trizol法提取心肌组织总RNA，qPCR检测炎症指标IL-1、IL-6及TNF-α的mRNA水平。

1.3细胞实验方法低糖对照组:低糖DMEM培养基(5.5 mmol/L)培养H9C2株心肌细胞，无其他干预。低糖+TFA组:低糖DMEM培养基(5.5 mmol/L)培养H9C2株心肌细胞，加浓度1 μg/mL TFA 1 mL。HG组:正常的DMEM培养基内加D-葡萄糖，配置成含葡萄糖浓度为33 mmol/L的高糖培养基，处理H9C2株心肌细胞2 h。HG+TFA组: 1 μg/mL TFA 1 mL预处理1 h后，高糖培养基培养H9C2株心肌细胞2 h。HG+pCNDA-p65组：H9C2细胞过表达p65，再予高糖培养基培养2 h。HG+TFA+pCNDA-p65组：H9C2细胞过表达p65，1 μg/mL TFA 1 mL预处理1 h后，再予高糖培养基培养2 h。

H9C2细胞给予TFA、高糖对应处理，通过细胞免疫荧光实验对比4组细胞NF-κB入核水平，应用qPCR检测细胞内IL-1、IL-6、TNF-α水平。在心肌细胞内过表达NF-κB后，比较4组细胞(HG组、HG+TFA组、HG+pCNDA-p65组及HG+TFA+pCNDA-p65组)的IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA水平。

2 结 果

2.1 秋葵总黄酮改善糖尿病小鼠的血糖与心重/体重比造模16周时，STZ组及STZ+TFA组的血糖显著高于对照组及TFA组(P<0.05)，STZ+TFA组血糖较STZ组有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，4组的心率差异无统计学意义(P>0.05)。STZ+TFA组心重/体重比显著低于STZ组(P<0.05)，见图1。

4组小鼠的生化指标显示：TFA组与对照组比较肝肾功能差异无统计学意义(P>0.05)。STZ组较对照组肾功能(尿素氮、肌酐)显著恶化(P<0.05)，胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇显著升高(P<0.05)，谷丙转氨酶、谷草转氨酶显著升高(P<0.05)。然而，TFA组与对照组、STZ+TFA组与STZ组生化指标差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

a：血糖；b：心率；c：心重/体重比

表 1 各组小鼠生化指标比较

2.2秋葵总黄酮改善糖尿病小鼠的心功能STZ组较对照组左室的射血分数(EF%)、E/A及FS%水平显著降低(P<0.05)，左室大小(LVIDd)显著扩大(P<0.05)。STZ+TFA组的左室的收缩功能(EF%)、舒张功能(E/A水平及FS%水平)、左室大小(LVIDd)较STZ组均得到明显改善(P<0.05)。见图2。

2.3秋葵总黄酮缓解糖尿病小鼠的心脏重构HE染色显示：STZ组较对照组平滑肌增殖、内皮细胞排列紊乱肿胀，STZ+TFA组较STZ组抑制了平滑肌增殖及内皮细胞紊乱。Masson染色显示：STZ组较对照组出现显著的心肌纤维化，STZ+TFA组较STZ组抑制了心肌纤维化。见图3。

2.4 秋葵总黄酮对糖尿病小鼠心肌中NF-κB的调控小鼠心脏组织的蛋白条带显示：与对照组比较，STZ组p-p65水平显著升高(P<0.01)，STZ+TFA组较STZ组抑制了p-p65的升高(P<0.05)。NF-κB p65水平4组间差异无统计学意义(P>0.05)。组织细胞核内的NF-κB蛋白水平结果显示：细胞核内NF-κB水平STZ组较对照组显著升高(P<0.01)，STZ+TFA组较STZ组抑制了细胞核内NF-κB的升高(P<0.05)。见图4。

a：心脏超声；b:EF%水平；c:E/A水平；d：FS%水平；e：LVIDd(mm)

图 3 镜下观察各组小鼠心脏组织形态

1:对照组；2：TFA组；3：STZ组；4：STZ+TFA组

2.5秋葵总黄酮对糖尿病小鼠心肌中炎症指标的调控与对照组比较，STZ组IL-1、IL-6、TNF-α mRNA水平显著升高(P<0.01)，STZ+TFA组较STZ组均显著抑制了IL-1、IL-6、TNF-α的升高(P<0.05)，见图5。

2.6 TFA明显减轻高糖介导的H9C2细胞内NF-κB入核与炎症因子表达不同条件下的H9C2细胞的炎症指标mRNA水平结果显示：HG组IL-1、IL-6、TNF-α表达水平较对照组上调(P<0.01)；与HG组比较，HG+TFA组 IL-1、IL-6、TNF-α水平的上调受到抑制(P<0.05)，见图6。免疫荧光检测4组不同条件下的H9C2细胞NF-κB入核水平，发现与对照组比较，HG组NF-κB入核显著增加，而HG+TFA组较HG组显著抑制了NF-κB入核,见图7。

a:IL-1；b:IL-6；c:TNF-α

a-c分别为IL-1、IL-6、TNF-α mRNA表达水平

图 7 NF-κB入核水平

2.7过表达NF-κB减弱TFA对高糖介导的H9C2细胞炎症因子高水平的抑制与HG组比较，HG+TFA组炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α表达显著减少(P<0.05)。与HG+TFA组比较，HG+TFA+pCNDA-p65组IL-1、IL-6、TNF-α表达水平均显著升高(P<0.01)，且与HG+pCNDA-p65组差异无统计学意义(P>0.05)，TFA下调IL-1、IL-6、TNF-α表达水平的作用明显减弱(P<0.05)，见图8。

*P<0.05、**P<0.01

3 讨 论

秋葵富含多糖、黄酮、生物碱及微量元素等有机化学成分，近来的科学研究证实其具有抗氧化、降糖、防癌、改善菌群失调等作用[18]。秋葵总黄酮在抗氧化及清除自由基等方面具有显著的作用[19]。本研究选择秋葵总黄酮为研究对象，首次证实秋葵总黄酮对糖尿病心肌病的心功能和心脏重构的改善作用，并首次证实其通过抑制炎症反应发挥作用，在动物水平秋葵总黄酮抑制了糖尿病小鼠心肌的炎性指标升高，在细胞水平秋葵总黄酮通过抑制心肌细胞NF-κB入核，下调其下游炎症因子。

3.1秋葵总黄酮对血糖血脂等生化指标的影响研究证实秋葵多糖(黏性物质)是秋葵具有降糖作用的主要有效活性成分。黄酮是一类多酚化合物，广泛存在于植物中，常与糖类结合成苷，因此具有很多种类，也具有各种各样的药理活性[20]。黄秋葵总黄酮中以异槲皮素和槲皮素-3-O-龙胆苷这2种多酚为主[21]。既往研究证实黄酮类化合物500 mg/(kg·d)具有一定的降低血糖的作用，也有研究证实其可能降血压和血脂[19]。本研究中我们应用高脂饮食联合单次STZ腹腔注射诱导的糖尿病小鼠模型(HFD+STZ)，构造2型糖尿病模型。我们发现秋葵总黄酮300 mg/(kg·d)有轻微降糖和降脂的作用，但无统计学意义。分析原因可能是相关的动物实验中使用的黄酮剂量较大，本研究的黄酮剂量不够大到显著降低血糖。当然，这一点还需要进一步的研究去证实。

在安全性方面，我们观察了实验小鼠的肝肾功能指标，发现300 mg/(kg·d)秋葵总黄酮无肝肾功能的损害，说明秋葵总黄酮无毒性，安全性高。

3.2秋葵总黄酮改善糖尿病小鼠的心脏结构及功能单味中药总黄酮在治疗糖尿病及其并发症方面的研究数量较多，但面广而不集中，关于秋葵总黄酮对糖尿病的靶器官保护方面的研究甚少，仅有一篇报道秋葵总黄酮改善糖尿病肾病的动物实验[22]。

本研究发现糖尿病小鼠的左心室舒张末直径、收缩末直径显著扩大，EF值下降，舒张功能下降，证实模型组出现糖尿病心肌病变以及心功能恶化，与既往文献报道相符。本研究进一步证实秋葵总黄酮明显改善了糖尿病心肌病小鼠的心脏大小及功能，在器官水平表现为心脏左心室舒张末直径缩小、EF值升高，在组织水平表现为心肌内皮细胞肿胀受损和平滑肌细胞的增殖减少、心肌纤维化水平降低。

3.3秋葵总黄酮抑制炎症反应炎症损伤是糖尿病心肌病的重要病理机制[23-26]。本研究发现秋葵总黄酮降低血糖不明显，但能显著抑制糖尿病心肌病的发生及进展，考虑作用机制与血糖的直接影响无关，而是独立于降糖以外的其他机制，抑制氧化应激及炎症反应从而改善糖尿病心肌病。

黄酮在清除自由基和抗氧化方面具有显著作用，能够保护心脏及抗衰老、防癌、改善血液循环等。有研究提示秋葵总黄酮通过抑制炎症反应改善糖尿病肾病[20]。我们研究发现糖尿病小鼠的心肌细胞中NF-κB表达增加，细胞核中NF-κB表达增加，也就是NF-κB的入核增加，同时，心肌细胞中IL-1、IL-6、TNF-α表达水平均显著增加。这与既往糖尿病机制的结果一致。给予秋葵总黄酮后小鼠心肌组织与细胞核中NF-κB表达下降，心肌组织内IL-1、IL-6、TNF-α表达明显下调。我们的细胞实验证实秋葵总黄酮能抑制高糖培养的心肌细胞NF-κB入核，并下调细胞内IL-1、IL-6、TNF-α水平，为了进一步验证，我们在心肌细胞内过表达NF-κB后，发现秋葵总黄酮不能再下调高糖刺激引起的高水平IL-1、IL-6、TNF-α，证实秋葵总黄酮是通过影响NF-κB继而影响下游的IL-1、IL-6、TNF-α水平。这些结果首次证实秋葵总黄酮通过抑制炎症反应抑制糖尿病小鼠的心室重构，从而抑制糖尿病心肌病的发生及发展。

秋葵总黄酮降低糖尿病小鼠的炎症指标，改善心功能和心室重构其可能机制是通过抑制细胞NF-κB入核下调炎症水平。