TCY-NH2对脑死亡大鼠胰腺炎性反应和细胞凋亡的影响

袁梓博，方红波，李 涛，冯泉凯，曹胜利，李 捷

0 引 言

胰腺或胰岛移植是治疗糖尿病的有效方法，可以控制血糖及其相关并发症[1-2]。目前，供胰主要源自脑死亡供体的捐献。然而，研究发现脑死亡诱导促炎细胞因子和促凝介质大量释放入血，激活全身炎性反应[3-4]。同样，脑死亡供胰中炎性介质表达上调，激活炎性反应[5]。促炎介质过早表达可促进移植过程中的炎性反应，加重缺血再灌注损伤，增加移植术后排斥和移植物功能障碍发生的风险[6]。研究发现，反-肉桂酰-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-酰胺三氟乙酸盐(Trans-Cinnamoyl-Tyr-Pro-Gly-Lys-Phe-amide trifluoroacetate salt，TCY-NH2)是肽类化合物，能抑制BALB/c小鼠体内中性粒细胞向胸膜腔的迁移，并减少中性粒细胞的滚动和黏附，降低炎性反应[7]。TCY-NH2可减弱血小板及免疫细胞的募集，改善缺血再灌注损伤[8]。TCY-NH2对胰腺炎症反应及细胞凋亡作用尚不明确，本研究拟通过构建大鼠脑死亡模型，探讨TCY-NH2作为干预靶点对脑死亡供胰的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物成年雄性SD大鼠18只，健康SPF级，体重300～350g，购自郑州华兴实验动物公司[动物许可证号: SCXK(豫)2019-0002]。所有大鼠均饲养在环境温度19～23 ℃，相对湿度 50% ～ 60%清洁动物房内，自由进食饮水。

1.2脑死亡模型采用缓慢间断颅内加压法诱导大鼠脑死亡，主要方法：戊巴比妥钠腹腔注射诱导麻醉，颅骨钻孔，硬脑膜外放置扩张导管球囊以加压诱导脑死亡，气管切开插管以备自主呼吸停后连接呼吸机，股动脉置管监测血压，尾静脉置管补液，膀胱造瘘监测尿量。当出现自主呼吸消失、角膜反射消失、深昏迷、脑电图波形平直时，判定大鼠脑死亡诱导成功。脑死亡期间，持续呼吸机通气，静脉输入羟乙基淀粉氯化钠注射液，维持平均动脉压>80 mmHg。

1.3实验分组随机将18只大鼠分为3组：脑死亡组，采用上述方法构建大鼠脑死亡模型，维持脑死亡状态6 h；假手术组，除不加压诱导脑死亡，余操作同脑死亡组；TCY-NH2组，在加压诱因脑死亡时将TCY-NH2(0.6 mg/kg，溶于等渗盐水)通过静脉注入大鼠体内，其余操作同脑死亡组。在脑死亡6 h后留取胰腺标本。

1.4免疫组化染色采用免疫组化染色法检测胰腺组织中的髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，以分析中性粒细胞浸润情况。石蜡包埋胰腺组织，切片4 μm厚，脱蜡、水化，EDTA(Ph9.0)液进行抗原修复，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，3%胎牛血清进行封闭，孵育MPO抗体(1∶200，武汉赛维尔)，孵育辣根过氧化物酶标记的二抗，DAB显色，封片。阳性为棕黄色，每个切片至少选3个视野进行分析。

1.5荧光实时定量PCR采用RNAiso Plus试剂盒(Takara)提取胰腺组织中总RNA，并用Nanodrop 2000测得RNA浓度。按照逆转录试剂盒(Takara)操作说明，将RNA逆转录成cDNA。按照SYBR©Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus，Takara)试剂盒操作说明配置反应体系，并在ABI7500快速实时PCR仪上进行检测。每个样本重复3次，GAPDH作为相对表达的内参基因。PCR中所用的基因引物：GAPDH引物5′- CTTGTGCAGTGCCAGCCTC-3′(上游)和5′-ATGAAGGGGTCGTTGATGGC-3′(下游)，IL-1β引物5-AGGAGAGACAAGCAACGACA-3′(上游)和5′-TTGTTTGGGATCCACACTCTCC-3′(下游)，TNF-α,引物5′- GTGATCGGTCCCAACAAGGA-3′(上游) 和5′- CGCTTGGTGGTTTGCTACG-3′(下游)，VCAM-1引物5′-GGAAATGCCACCCTCACCTT-3′(上游)和5′- AACAGTAAATGGTTTCTCTTGAACA-3′(下游)，ICAM-1引物5′- AAGCTCTTCAAGCTGAGCGA-3′(上游)和5′-CGCTCTGGGAACGAATACAC-3′(下游)。

1.6Western blot分析用磷酸化蛋白提取试剂盒(索莱宝)提取胰腺组织的总蛋白，并用上样缓冲液煮沸变性。根据目的蛋白分子大小选用12% 或15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转染至PVDF膜。用一抗p-IκBα 抗体(Cell Signaling Technology 公司), p-p65 抗体(Cell Signaling Technology公司)、IκBα 抗体(Proteintech 公司)、Bcl2抗体(Proteintech公司)、Bax抗体(Proteintech公司)、cl-Caspase-3抗体 (Proteintech公司) 和GAPDH抗体 (Proteintech公司)孵育4 ℃过夜，二抗孵育后用ECL化学发光液进行显像，用C-DiGit印迹扫描仪进行检测并用图像分析系统进行定量分析。GAPDH为上样内参蛋白。

1.7细胞凋亡检测将石蜡包埋胰腺组织切片，厚4 μm，采用原位细胞凋亡检测试剂盒(赛维尔)检测胰腺组织的凋亡细胞(呈绿色)，用DAPI对细胞核进行染色(呈蓝色)。荧光显微镜进行观察，每个切片至少选3个视野进行分析。

2 结 果

2.1 胰腺组织中性粒细胞浸润情况与脑死亡组胰腺组织浸润的中性粒细胞(4.20±2.79)比较，TCY-NH2组、假手术组(0.70±1.00、0.40±0.66)明显减少(P<0.05)。这表明TCY-NH2可以减轻脑死亡供胰组织的中性粒细胞浸润情况。见图1。

a:假手术组; b:脑死亡组; c:TCY-NH2组

2.2胰腺组织中炎症介质的表达情况与脑死亡组比较，TCY-NH2组、假手术组的胰腺组织中IL-1β、TNF-α、VCAM-1、ICAM-1的mRNA表达明显降低(P<0.05)。这表明阻断TCY-NH2可以降低脑死亡供胰组织中炎性介质的表达。见表1。

2.3胰腺组织中NF-κB通路相关蛋白的变化与脑死亡组比较，TCY-NH2组、假手术组的胰腺组织中p-IκBα和p-p65的蛋白表达明显降低，IκBα蛋白表达明显升高(P<0.05)。这表明TCY-NH2可以抑制脑死亡供胰组织中NF-κB通路激活。见图2。

表 1 荧光实时定量PCR检测胰腺组织中细胞因子的mRNA相对表达水平

与假手术组比较，*P<0.05;与脑死亡组比较，#P<0.05

2.4胰腺组织中细胞凋亡情况与脑死亡组的胰腺组织中细胞凋亡(2.50±1.96)比较，TCY-NH2组、假手术组(0.60±0.66、0.30±0.46)明显减少(P<0.05)。这表明TCY-NH2可以减轻脑死亡供胰组织中细胞凋亡。见图3。

a:假手术组; b:脑死亡组; c:TCY-NH2组

2.5胰腺组织中凋亡相关蛋白的变化与脑死亡组比较，TCY-NH2组、假手术组的胰腺组织中Bax和cl-Caspase3的蛋白表达明显降低(P<0.05)，Bcl2蛋白表达明显升高(P<0.05)。这表明TCY-NH2可以调控脑死亡供胰组织中凋亡相关蛋白的表达。见图4。

与假手术组比较，*P<0.05;与脑死亡组比较，#P<0.05

3 讨 论

全身炎性反应是脑死亡供体的重要特征，影响脑死亡供体器官的质量和移植效果[6]。有文献报道：脑死亡病人的血清中IL-1和TNF-α浓度明显升高，胰腺组织TNF-α蛋白表达上调[5]。本研究发现脑死亡大鼠胰腺组织中炎症相关基因IL-1β、TNF-α、VCAM-1和ICAM-1表达上调，中性粒细胞浸润明显增多，NF-κB通路被激活。这些研究结果显示脑死亡引起了供体胰腺组织中的炎性反应，进一步验证脑死亡可以引起全身炎性反应。脑死亡阶段激活的炎性反应可以导致胰腺损伤。胰高血糖素样肽-1受体激动剂Exendin-4预处理脑死亡大鼠，可以下调胰腺组织中IL-1β基因表达，增强胰岛细胞的活力及葡萄糖刺激后胰岛素分泌能力[9]。IL-1受体拮抗剂预处理脑死亡大鼠，可以下调炎性细胞因子的表达，抑制中性粒细胞的迁移和激活，改善细胞线粒体功能障碍，提高胰岛活力及移植效果[10]。然而，目前这些干预方法尚未应用于临床，仍需探索新的治疗方式。

本研究发现用TCY-NH2处理脑死亡大鼠，可以减轻脑死亡大鼠胰腺组织的炎性反应，主要表现为中性粒细胞浸润减少、细胞因子(IL-1β、TNF-α、VCAM-1和ICAM-1)表达下调、NF-κB通路被抑制(p-IκBα和p-p65的蛋白表达明显降低，IκBα蛋白表达明显升高)。NF-κB信号是炎性反应中的经典通路，炎性信号刺激细胞后，胞内的IκB发生磷酸化，随后被蛋白酶降解以释放NF-κB，促使NF-κB激活并转至细胞核[11]；p65是NF-κB的重要组分，其磷酸化可增强NF-κB的转录活性，调控IL-1β、IL-6、TNF-α、VCAM-1、ICAM-1等炎性细胞因子的表达，参与机体炎性反应[12]。ICAM-1和VCAM-1是介导白细胞和血管内皮细胞间黏附的重要分子，促进白细胞游走并参与炎性反应[13-14]。我们认为上调的ICAM-1和VCAM-1参与脑死亡供体胰腺组织中的中性粒细胞浸润。中性粒细胞作为血液中占比最高的白细胞，是急性期炎性反应的参与者，释放促炎细胞因子以募集白细胞或诱导细胞损伤，参与糖尿病人胰腺及相关靶组织的病理进展过程[15]。综上，我们认为TCY-NH2通过抑制NF-κB通路，下调炎性因子表达，减少中性粒细胞募集，降低脑死亡供体胰腺组织中的炎性反应。

本研究发现脑死亡大鼠胰腺组织中细胞凋亡明显增加、cl-Caspase3蛋白明显上调，与我们之前在脑死亡供体肝脏中的研究发现一样[16]。脑死亡供体胰腺中上调的IL-1β和TNF-α可能引起细胞凋亡的重要诱因。文献报道：IL-1β在脑死亡供胰获取、分离、培养、植入过程大量产生，能启动或放大急性炎性反应，减少胰岛β细胞内胰岛素的合成和分泌或引起胰岛β细胞凋亡，导致移植失败[17]；TNF-α是经典的细胞凋亡诱导分子，与其受体结合后激活胰腺细胞凋亡[18]。下调或阻断这些炎性介质可以减轻炎性反应和细胞凋亡，然而目前鲜有临床干预方法。

本研究发现用TCY-NH2处理脑死亡大鼠，可以减轻脑死亡大鼠胰腺组织中细胞凋亡，明显下调Bax和cl-Caspase3的蛋白表达，明显上调Bcl2蛋白表达。Bax蛋白在线粒体外膜形成低聚体，参与细胞色素C的释放，促进内源性细胞凋亡；相反Bcl2蛋白通过阻断Bax蛋白低聚反应，抑制线粒体细胞凋亡途径；Caspase3在凋亡过程中被降解剪切成活性形式，是细胞凋亡的执行蛋白；过表达Bcl2、敲除Bax或抑制Caspase3均可抑制细胞凋亡[19]。有研究表明：TCY-NH2是选择性PAR4拮抗肽，可抑制小鼠颅脑损伤组织中细胞凋亡[20]；敲除PAR4基因抑制了小鼠心肌缺血再灌注中的细胞凋亡和Caspase3蛋白活性，同时上调Bcl2蛋白表达水平[21]。因此，我们认为TCY-NH2能减轻脑死亡诱导的胰腺细胞凋亡。

综上所述，本研究表明TCY-NH2可以减轻脑死亡供体胰腺中炎性反应和细胞凋亡，为提高脑死亡供胰质量提供潜在的干预方法。