依达拉奉右莰醇调控Nrf2/HO-1对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的保护作用

晚 丽，李作孝

0 引 言

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种自身免疫性疾病，以中枢神经系统炎性细胞浸润及多灶性脱髓鞘为主要病理特征[1]。全球大约有250万的MS患者，是青年人致残的重要疾病之一[2]。MS发病原因不详，机制复杂，多项研究表明炎症诱导的氧化应激在MS脱髓鞘及轴突损伤中起着重要作用，是推动疾病进展的主要机制之一，抑制氧化应激可阻碍MS病程进展[3]。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是研究MS的最常用动物模型[1]。核因子E2相关因子2/血红素加氧酶(nuclear factor-erythroid-2 related factor-2/heme oxygenase 1，Nrf2/HO-1)是机体内重要的抗氧化调节通路，激活后可起到抗氧化、抗炎、稳定线粒体、调控细胞死亡等作用[4]。依达拉奉是一种抗氧化剂，有研究显示依达拉奉可通过上调Nrf2及HO-1表达抑制氧化应激，从而缓解EAE大鼠临床症状[5]。依达拉奉右莰醇是在依达拉奉基础上加入了右莰醇的复方制剂，有研究表明其具有更强的抗氧化应激作用[6]。但目前关于依达拉奉右莰醇是否通过调控Nrf2/HO-1表达影响EAE小鼠疾病进展笔者暂未见报道。本实验通过依达拉奉右莰醇干预EAE小鼠，观察依达拉奉右莰醇对EAE小鼠的作用并探讨其机制是否与Nrf2/HO-1有关，为MS的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康雌性C57BL/6小鼠40只，SPF级，6～8周龄，体重(20±2)g，由湖北实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2020-0018。饲养条件：室温(24±2)℃，湿度50%左右，12 h光/暗循环，自由进食及饮水。实验前适应性喂养1周。伦理编号：2021-0601-3。

1.2药品及试剂依达拉奉右莰醇注射用浓溶液(南京先声东元制药有限公司)；依达拉奉注射液(上海麦克林生化科技有限公司)；MOG35-55多肽(国泰生物)；结核杆菌H37Ra(BD公司)；完全弗式佐剂、百日咳毒素均购自美国sigma公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；兔抗Nrf2抗体(CST公司)；兔抗HO-1、GAPDH抗体(abcam公司)，HRP标记的山羊抗兔IgG(Aspen公司)。

1.3分组、造模及干预采用随机数字表法将40只小鼠分为空白对照组、EAE模型组、依达拉奉右莰醇干预组以及依达拉奉干预组，各10只。参照文献[7]方式造模，将MOG35-55多肽稀释为5 g/L，加入相同体积含结核杆菌的完全弗氏佐剂(结合杆菌最终浓度为5 g/L)。推打形成油包水型乳剂，在后3组小鼠脊椎旁任选4点进行皮下注射(每只0.1 mL)，空白对照组注射等量等渗盐水。在免疫的第0和48小时，后3组腹腔注射0.5 mL百日咳毒素(200 ng/只)，空白对照组注射等量等渗盐水。自造模次日起，依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组分别腹腔注射依达拉奉右莰醇12.5 mg/kg及依达拉奉10 mg/kg，空白对照组及EAE模型组注射等量等渗盐水，1次/d，连续14 d。

1.4小鼠发病情况观察小鼠免疫后，每日同一时间由两位实验员分别对各组小鼠进行神经功能障碍评分，评分采用Benson评分标准：0分(无症状)；1分(尾部下垂)；2分(双后肢无力)；3分(双后肢瘫)；4分(四肢瘫)；5分(濒死状态或死亡)；介于两项之间者以±0.5计分。并记录小鼠的进食、饮水、活动、毛发、体重等情况。以评分1～5分判定为小鼠发病，造模到开始发病时间记为潜伏期，开始发病到发病高峰期(连续3日神经功能障碍评分不增加)记为进展期，发病小鼠于发病高峰期处死，未发病小鼠及空白对照组小鼠观察到造模后28 d处死，取脊髓和脑室周围组织。一部分脊髓组织浸泡在4%多聚甲醛中充分固定24 h并制成4 μm和6 μm石蜡切片，脑组织和另一部分脊髓组织放在-80 ℃冰箱中备用，分别用于生化分析和Western blot检测。

1.5脊髓组织病理学检查每组随机选取3张4 μm石蜡切片进行HE染色，检测炎性细胞浸润情况(依次进行脱蜡、苏木精染色、伊红染色、脱水封片、镜下观察并拍照)。另外选取3张6 μm石蜡切片进行LFB染色，检测脱髓鞘情况(依次进行脱蜡、醇化、Luxol Fast Blue染液中染色、分化、镜检、风干、封固、镜下观察并拍照)。

1.6生化检测脑组织匀浆中氧化应激指标水平取冻存脑室周围脑组织0.5 g，冰水洗涤，切割，等渗盐水稀释至十倍，制成脑组织匀浆。然后以离心半径18 cm，3000 r/min离心15 min以收集上清液。按试剂盒说明测定MDA(比色法)、ROS(化学发光法)含量及SOD(黄嘌呤氧化酶法)、CAT(紫外分光法)活性。

1.7 Westernblot检测脊髓组织中Nrf2和HO-1蛋白表达水平取小鼠冻存脊髓组织，清洗，提取蛋白，使用BCA蛋白浓度试剂盒检测蛋白浓度。按照样品浓度计算上样体积，每孔40 μg蛋白，加入5×蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min，SDS-PAGE电泳。使用甲醇活化PVDF膜后进行常规转膜操作。转好的膜使用封闭液在常温下处理1 h，加入稀释好的一抗[兔抗Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶2000)、GAPDH(1∶10 000)抗体]4 ℃过夜，回收一抗，冲洗，再加入稀释好的二抗(HRP标记的山羊抗兔抗体，1∶10 000)，室温孵育30 min，进行ECL反应，暗室曝光。最后用AlphaEaseFC软件分析，以GAPDH为内参，得出蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 各组小鼠行为学比较空白对照组均无异常表现，其余各组不同程度发病。发病小鼠出现精神萎靡、食欲下降、体重减轻等情况，神经系统障碍依次出现尾部张力下降、后肢瘫痪伴或不伴有前肢瘫痪、双便失禁等临床表现。与EAE模型组相比，依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组发病潜伏期延长、进展期缩短、高峰期神经功能障碍评分降低，依达拉奉右莰醇干预组更明显(P<0.05)，见表1。

表 1 各组小鼠行为学比较

2.2各组小鼠脊髓组织病理学改变空白对照组脊髓组织未见异常；EAE模型组发病高峰期脊髓组织可见大量炎性细胞浸润，以单核细胞浸润为主，脊髓白质可见大片白色脱髓鞘区域，脊髓组织严重肿胀及空泡形成。给予依达拉奉右莰醇及依达拉奉干预后脊髓组织炎性细胞浸润及脱髓鞘情况减轻，依达拉奉右莰醇干预组最轻。见图1。

2.3各组小鼠脑组织匀浆中氧化应激指标水平比较与空白对照组相比，EAE模型组脑组织匀浆中MDA和ROS含量升高，SOD和CAT活性降低(P<0.05)。与EAE模型组相比，依达拉奉右莰醇及依达拉奉干预组脑组织匀浆中MDA和ROS含量降低，SOD和CAT活性升高，依达拉奉右莰醇干预组效果更明显(P<0.05)。见表2。

2.4 各组小鼠脊髓组织中Nrf2和HO-1表达水平比较与空白对照组相比，EAE模型组脊髓组织中Nrf2及HO-1表达水平升高(P<0.05)；与EAE模型组相比，依达拉奉右莰醇干预组及依达拉奉干预组脊髓组织中Nrf2及HO-1表达水平升高，依达拉奉右莰醇干预组升高更明显(P<0.05)。见表3，图2。

图 1 各组小鼠脊髓组织病理学改变

表 2 各组小鼠脑组织匀浆中氧化应激指标水平比较

表 3 各组小鼠脊髓组织中Nrf2和HO-1表达水平比较

1：空白对照组；2：EAE模型组；3：依达拉奉右莰醇干预组；4：依达拉奉干预组

2.5 各组小鼠脊髓组织中Nrf2、HO-1表达水平与脑组织匀浆中氧化应激指标水平的相关性分析各组小鼠脊髓组织中Nrf2、HO-1表达水平与脑组织匀浆中SOD、CAT活性呈正相关，与脑组织匀浆中MDA、ROS含量呈负相关(P<0.05)，见表4、表5。

表 4 各组小鼠Nrf2表达水平与氧化应激指标水平的相关性

表 5 各组小鼠HO-1表达水平与氧化应激指标水平的相关性

3 讨 论

MS是一种神经系统慢性炎症性疾病，致残率高，给患者及家庭带来了极大负担[2]。MS急性期治疗主要以激素冲击及丙种球蛋白为主，价格昂贵且副作用多，多种疾病修饰药物禁忌症较多[8]，故寻找安全有效的治疗药物是目前研究的重点。依达拉奉是一种神经保护剂，其具有副作用少，机体耐受好等优势，是目前临床缺血性脑卒中的一线治疗药物[9]。除此之外，依达拉奉在自身免疫性疾病中也有广泛研究，许多证据表明依达拉奉可抑制EAE的发生发展，可能是通过抗氧化、抑制炎性细胞浸润及炎症因子表达、促进髓鞘再生等发挥作用，其中抗氧化起主导作用[5，10]。同时有研究证明依达拉奉和右莰醇以4∶1比例组成的复方制剂依达拉奉右莰醇中两种成分具有协同增效作用，使其具有比依达拉奉更强的抗氧化效应[6]。但目前关于依达拉奉右莰醇对EAE小鼠的作用笔者暂未见文献报道。EAE小鼠是研究MS常用的动物模型，本研究发现经MOG35-55多肽免疫后的小鼠逐渐精神不振、体重下降及不同程度身体瘫痪，病理检测发现脊髓组织大量炎症细胞浸润及大片髓鞘脱失，与人类的MS临床及病理表现相似，提示造模成功。经依达拉奉右莰醇及依达拉奉干预后，小鼠发病潜伏期延长、进展期缩短、高峰期神经功能评分降低、脊髓炎性细胞浸润及脱髓鞘程度减轻，依达拉奉右莰醇干预组效果更明显。说明依达拉奉右莰醇对EAE小鼠具有神经保护作用，且作用强于依达拉奉。生理状况下，机体氧化-抗氧化趋于平衡。在MS病理过程中，炎症诱导的活化免疫细胞、脱髓鞘产生的铁沉积、线粒体功能障碍等都可导致ROS产生增加，过量产生的ROS消耗抗氧化酶，导致氧化-抗氧化失衡[3]。ROS不仅可直接破坏机体内的脂质、DNA、蛋白质，产生过多的过氧化物，如MDA[11]；还可以启动细胞凋亡、促进髓鞘吞噬、增加血脑屏障的通透性，并促进淋巴细胞向中枢迁移[12]；除此之外，ROS还可激活炎症转录因子核因子κB(nuclear factor κB,NF-кB)，启动炎症级联反应[13]。多种途径共同作用最终导致MS进展。有研究发现MS患者脑脊液中存在大量脂质过氧化物[14]，且ROS水平明显升高[15]。SOD和CAT作为机体重要的抗氧化酶，可快速清除ROS减少氧化损伤[16]。Singh等[17]研究发现依达拉奉可清除自由基，上调抗氧化酶SOD和CAT表达。同时有研究显示依达拉奉右莰醇具有比依达拉奉更强的自由基清除效应[6]。本实验发现与空白对照组相比，EAE模型组脑组织匀浆中ROS和MDA含量显著升高，SOD和CAT活性显著降低，进一步证实EAE发病高峰期存在氧化应激损伤。经依达拉奉右莰醇及依达拉奉干预均可降低脑组织匀浆中ROS和MDA含量，升高SOD和CAT活性，且依达拉奉右莰醇干预组更明显。提示依达拉奉右莰醇对EAE小鼠的保护作用可能与上调抗氧化酶表达，清除ROS，从而抑制氧化应激有关，其作用效果强于依达拉奉。

Nrf-2是抗氧化关键调节因子，在氧化应激条件下，与细胞质中抑制蛋白Keap-1解离，磷酸化后迅速转移至细胞核内与一种小Maf蛋白形成异二聚体，最后与抗氧化反应原件(activating response element，ARE)结合，调控下游相关的基因表达，发挥各种生理作用，如调控抗氧化酶SOD、CAT以及II相解毒酶HO-1等的表达，SOD和CAT可快速清除体内ROS[18]，HO-1可还原胆红素为胆绿素，并产生内源性抗氧物质CO和Fe+,共同起到抗氧化作用[19]。因此Nrf-2成为抗氧化干预的靶点。Nrf2在EAE中广泛研究，Nellessen等[20]研究表明Nrf2基因敲除的EAE小鼠出现更严重的氧化应激及神经炎症，并且脱髓鞘、轴突损伤和神经元变性更明显。同时Long等[16]研究表明激活Nrf-2对EAE具有防治作用。张巧莲等[5]研究显示依达拉奉可通过上调Nrf-2及HO-1表达抑制氧化应激，从而对EAE大鼠发挥神经保护作用。Shou等[21]研究表明在毒死蜱诱导的神经损伤中，依达拉奉也可通过激活Nrf-2，上调SOD表达，并降低ROS和MDA含量发挥神经保护作用。以上证据均证明依达拉奉可通过激活Nrf-2抑制氧化应激。依达拉奉右莰醇被证实抗氧化作用强于依达拉奉[6]，但其抗氧化机制是否与Nrf-2/HO-1相关尚不明确。本实验发现EAE模型组脊髓组织中Nrf-2和HO-1表达水平高于空白对照组，与前人研究一致，可能原因是EAE发病高峰期氧化应激可以激活Nrf2/ARE通路，并诱导Nrf2及HO-1的表达[16]。经过依达拉奉右莰醇及依达拉奉干预后，脊髓组织中Nrf-2和HO-1表达水平均较EAE模型组升高，且依达拉右莰醇组升高更加明显。同时，对Nrf-2、HO-1表达水平与氧化应激指标水平的相关性分析显示：Nrf-2、HO-1变化趋势与SOD、CAT基本相同，与MDA、ROS基本相反。表明依达拉奉右莰醇可能通过调控Nrf-2/HO-1表达，提高抗氧化酶活性，降低机体氧化水平，抑制脂质过氧化，从而对EAE小鼠具有保护作用，且效果强于依达拉奉。

综上所述，依达拉奉右莰醇对EAE小鼠具有神经保护作用，且作用强于依达拉奉。可能原因是依达拉奉右莰醇对Nrf2/HO-1具有更强的调控作用，更能上调抗氧化酶表达，抑制脂质过氧化水平。本文初步探索了依达拉奉右莰醇对EAE小鼠发挥保护作用的机制，但其保护作用是否还涉及其他机制还需进一步研究。