miRNA-122、224在肝细胞癌患者肝组织和血清中的表达水平及临床意义

王海溥 郭俊强 岳爱民

原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝细胞或肝内胆管细胞发生癌变导致的疾病，是我国最为常见的消化系统肿瘤。其致死率在所有肿瘤中位列第三，具有恶性程度高、病死率高、预后差等特点[1,2]，且一经发现常为晚期，大多数患者已失去手术治疗的价值，而目前针对晚期HCC的治疗手段仍为传统放化疗。近年来索拉菲尼用于治疗晚期HCC的效果较为显著[3]，但晚期HCC患者的五年生存率仍低于30%。HCC严重威胁我国人民的健康，寻找有效治疗HCC的方法十分重要。现阶段的许多研究从分子生物学角度入手，探究HCC的发病原因和机制，寻找新的HCC相关靶点，为HCC的临床治疗寻找理论依据。近年来报导的与HCC相关研究多与微小RNA(mircoRNA，miR)相关，有研究表明miR-122和miR-224的表达与HCC的发生、发展和预后密切相关[4,5]。本研究对本院收治的肝癌患者血清和组织中miR-122和miR-224表达水平进行检测，旨在为HCC的诊断和治疗提供新的思路，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择本院肝胆外科2017年3月至2020年3月接受肝脏恶性肿瘤根治术的62例HCC患者作为研究对象，其中男性35例，女性27例纳入研究组。纳入标准：①术中病例确诊为HCC，患者全部符合HCC诊断标准[6]；②患者未接受过放、化疗和靶向治疗；③流行病学资料和临床资料完整，包括患者年龄、性别、病理分级、肿瘤直径等。排除标准：①其他肝脏占位病变；②患者接受过放疗、化疗和靶向治疗；③未在我院接受治疗者；④伴有严重脏器功能损害患者。选择同期医院收治非恶性肝占位病变患者62例，作为对照组其中男性31例，女性31例，收集肝脏组织。研究组患者年龄35～75岁，平均年龄(53.3±4.7)岁；对照组年龄32～71岁，平均年龄(51.6±3.4)岁。本研究纳入对象均签署对研究的知情同意书并经医院医学伦理委员会审核通过。

1.2 肝细胞癌组织中miRNA-122和miRNA-224的检测

使用Trizol试剂盒(购买自北京天根生化有限公司)提取组织中总RNA，使用Nanodrop仪器检测RNA样品质量，OD260/OD280数值>1.8证明所提取RNA质量较好，无污染。提取到的样品置于-80 ℃保存备用。在总样品中提取1 μl总RNA进行逆转录，使用SuperScript IV Reverse Transcriptase(购买自美国thermofisher公司)逆转录试剂盒按照说明书合成cDNA，反应条件为55℃ 10 min，80℃ 10 min针对目标序列使用Primer premier6.0设计引物，由上海生工有限责任公司合成引物。miRNA-122上游引物序列为：5'-CCATACCACCCTGAACGC-3'，下游引物序列为：5'-GTATTCCCAGGCGGTCTC-3'；miRNA-224上游引物序列为：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列为：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；U6引物上游序列为：5'-CGCTTCGGCAGACATATAC-3'，下游引物序列为：5'-AAATATGGAACGCTTCACGA-3'。以cDNA作为模板，U6引物作为内参，使用q-PCR技术检测miRNA-122和miRNA-224在HCC患者和非恶性肝占位病变患者组织中的相对表达情况。建立20 μl反应体系，上游引物0.4 μl、下游引物0.4 μl、cDNA模板1 μl、dd H2O 7.8 μl、q-PCR Mix反应液10.4 μl。反应条件为92℃预变性5 min，然后92℃ 60 s、54℃ 60 s、72℃ 60 s进行30个循环。反应在PCR仪(HEMA96TC珠海黑马医学仪器有限公司)中进行。miRNA-122和miRNA-224相对表达使用2-△△Ct法进行测定。△△Ct=(CTmiRNA-CTU6RNA)实验组-(CTmiRNA-CTU6RNA)对照组。

1.3 患者血清中miRNA-122和miRNA-224的检测

采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，检测HCC患者和非恶性肝占位病变患者血清中miRNA-122和miRNA-224表达水平。实验组与对照组患者均在入院后次日晨起空腹时抽取静脉血4 ml于抗凝管中，离心制备血清，使用ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)并严格按照试剂盒中说明书所示操作步骤，检测患者血清中miRNA-122和miRNA-224的表达水平。检测后使用酶标仪检测其浓度，与标准曲线对比得出检测结果。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两组miRNA-122和miRNA-224水平比较

结果表明：研究组组织中miRNA-122水平为(1.26±0.33)，对照组为(3.65±0.53)，研究组低于对照组(P<0.001)；研究组组织中miRNA-224水平为(4.19±0.41)，对照组为(2.56±0.32)，研究组高于对照组(P<0.001)。

2.2 两组血清中miRNA-122和miRNA-224水平比较

结果表明：研究组血清中miRNA-122水平为(39.12±4.13)，对照组为(73.65±7.26)，研究组低于对照组(P<0.001)；研究组血清中miRNA-224水平为(74.96±9.58)，对照组为(41.87±3.14)，研究组高于对照组(P<0.001)。

2.3 肝细胞癌组织中miRNA-122和miRNA-224水平与其临床病理特征的关系

HCC患者组织中miRNA-122低表达和miRNA-224高表达与肿瘤直径、病理分期、淋巴结转移和外周血甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)水平相关，差异具有统计学意义(P<0.05)；与患者年龄和性别无关，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 HCC组织中miRNA-122和miRNA-224水平与其临床病理特征的关系

2.4 肝细胞癌患者血清中miRNA-122和miRNA-224水平与其临床病理特征的关系

HCC患者血清中miRNA-122低表达和miRNA-224高表达与肿瘤直径、病理分期、淋巴结转移和外周血AFP水平相关(P<0.05)；与患者年龄和性别无关(P>0.05)，见表2。

表2 HCC患者血清中miRNA-122和miRNA-224水平与其临床病理特征的关系

3 讨论

HCC是常见的消化系统恶性肿瘤之一。早期HCC患者常无明显症状和体征，难以被发现，大多数患者一经诊断即为中晚期，失去手术的最佳时机。中晚期HCC具有恶性程度高、对传统放化疗不敏感、手术治疗后易复发等特点，患者五年生存率较低[7]。外科手术治疗是HCC患者早期主要的治疗手段，近几年对腹腔镜下肝癌切除术的研究和报导逐渐增多，因其创伤小和出血少的优点逐渐代替传统手术治疗[8]。晚期HCC患者的主要治疗手段为化疗，研究发现经导管肝动脉化疗栓塞术(TACE术)和索拉菲尼治疗中晚期肝癌的效果优于传统化疗，但患者预后仍较差[9-10]，故HCC的早期诊断在HCC的治疗过程中十分重要。

miRNA是一种长度为20～25个核苷酸的单链非编码RNA分子，之前的研究表明许多miRNA不仅参与人体的正常生命活动，在某些疾病的发生和发展中也起重要的作用[11]。如miR-95的高表达具有促进骨肉瘤的侵袭和转移，抑制肿瘤细胞的凋亡的作用[12]；miR-9在胃癌细胞中的过表达可以促进胃癌细胞的生长和转移，抑制肿瘤细胞凋亡[13]；miR-17在乳腺癌组织中高表达通常与患者预后不利良密切相关[14]。本研究中miR-122是一种在肝脏中高表达的miRNA，参与了肝脏的多种生理功能，还具有抑制肝癌细胞增殖和促进其凋亡的作用[15-16]。有研究表明miR-122在HCC组织中表达水平降低，且miR-122的低表达与HCC的复发、转移和预后不良密切相关[17]。最近研究表明miR-224在直肠癌、非小细胞癌、乳腺癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中均有高表达现象，而且miR-224可通过基质金属蛋白酶-2(MMP-2)基因调控肿瘤细胞的侵袭和转移[18-19]。

本研究通过使用q-PCR和ELISA法对研究组62例HCC患者和对照组62例非恶性肝占位病变患者肝脏组织中和血清中的miR-122和miR-224的表达水平进行比较，结果显示HCC患者肝脏组织和血清中的miR-122水平较非恶性肝占位病变患者相比显著下降(P<0.001)；而HCC患者肝脏组织和血清中的miR-224水平明显上升(P<0.001)，比较文献结果与之前的报导相吻合[20-21]。本研究还发现HCC患者肝脏组织和血清中miR-122的低表达与miR-224的高表达与患者性别和年龄无关(P>0.05)，但和HCC肿瘤直径、病理分期、淋巴结转移和外周血AFP水平密切相关(P<0.05)。此研究结果表明，可通过检测患者血清和肝脏组织中miR-122和miR-224的表达水平对HCC肿瘤大小、病理分期和有无转移进行初步判断。

综上所述，患者血清和肝脏组织中miR-122和miR-224的表达水平与患者年龄和性别无关，但对HCC的肿瘤大小、病理分期和有无转移具有一定的判断价值，但其机制尚不明确，有待进一步研究。