骨肉瘤患者血清中miR-34a、miR-449a表达及与新辅助化疗耐药的关系

楚利涛 李兴华 朱梁豫 辛晓林 魏 瑄 骆晓飞

骨肉瘤是骨组织最常见的原发性恶性肿瘤，其恶性程度较高，并常见于青少年。目前关于骨肉瘤发生机制研究常处于探索中，与青春期骨生长过快和遗传等因子有关[1]。骨肉瘤主要发生在膝关节周围，可能和青春期股骨远端和胫骨近端的骨骺快速生长关密切[2]，且女性患者发病高峰稍早于男性。有数据报道[3]，手术联合化疗治疗后5年生存率为55%～65%，常见于肺部转移，且2年生存率不到25%。最近几年关于基因在骨肉瘤发生和发展过程中的作用越来越多，认为基因治疗是一种有效途径[4]。MicroRNA(miRNA)可以特异性识别靶基因的3'短非翻译区而对其表达起到负性调节作用。miR参与肿瘤发生、转移和治疗及预后等。miR-34a和miR-449a表达水平影像肿瘤发生和发展。本文选择医院2019年1月至2020年1月诊治的骨肉瘤患者，给与新新辅助化疗前检测血清中miR-34a、miR-449a表达水平，现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

随机选择医院2019年1月至2020年1月诊治的骨肉瘤83例，将其纳入研究组。研究组纳入标准：①病理确诊；②知情同意患者；③首次确诊和治疗的患者；④新辅助化疗患者。排除标准：①合并其他恶性肿瘤患者；②复发患者；③免疫系统紊乱患者；④活动性出血患者；⑤妊娠期、哺乳期患者。另选取同期体检健康受试者83例，将其纳入对照组。对照组纳入标准：① 8～28岁受试者；②知情同意；③自愿参加。研究组，年龄6～17岁，平均(11.06±1.29)岁，男性43例，女性40例。对照组，年龄5～27岁，平均(20.07±1.28)岁，男性44例，女性39例。两组患者一般资料差异比较无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

血清miR-34a、miR-449a检查：抽取两组受试者空腹血液3 ml，低速离心(20 min)处理后留下血清，将上层血清转移到新试管中，储备。按照血清RNA提取试剂盒指令提取，采用实时定量逆转录聚合酶联式反应检测血清miR-34a、miR-449a水平。临床病理特征：使用问卷调查法收集患者临床病理特征，包括年龄、性别、肿瘤位置、分期。

新辅助化疗方案：第一周期大剂量MTX方案:MTX 200 mg/kg或8～12 g/m2；第二周期IFO方案:2～3 g/m2，连用5天;第三周期AP方案:用法ADM 60 mg/m2，DDP 120 mg/m2，每一周期间隔12天左右，3个周期为一个疗程。

化疗反应：根据化疗结果将其分成无效化疗组和有效化疗组，分别为31例和52例。

1.3 评价指标

比较两组患者血清miR-34a、miR-449a水平，分析血清miR-34a、miR-449a水平与骨肉瘤患者临床病理特征的关系，对比化疗有效和无效患者治疗前后血清miR-34a、miR-449a水平。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 两组受试者血清miR-34a、miR-449a水平比较

研究组患者血清miR-34a水平(6.47±1.28)明显高于对照组(P<0.05)，miR-449a水平(29.47±1.23)低于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组受试者血清miR-34a、miR-449a水平比较

2.2 血清miR-34a、miR-449a水平与骨肉瘤病理特征的关系

不同年龄、性别、肿瘤部位患者血清miR-34a、miR-449a水平比较无统计学意义(P>0.05)。不同肿瘤大小、分期患者的血清miR-34a、miR-449a水平比较有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 血清miR-34a、miR-449a水平与骨肉瘤临床病理特征的关系

2.3 血清miR-34a、miR-449a表达水平及与新辅助化疗耐药关系分析

化疗有效组血清miR-34a表达水平(7.09±1.09)明显低于无效组(P<0.05)，miR-449a表达水平(33.74±2.06)明显高于化疗无效组(P<0.05)，见表3。

表3 血清miR-34a、miR-449a表达水平及与新辅助化疗耐药的关系

3 讨论

骨肉瘤也称为成骨肉瘤，是骨的原发性恶性肿瘤，在原发性骨肿瘤中骨肉瘤发生率仅次于浆细胞骨髓瘤。目前认为，骨肉瘤出现转移的风险为20%，常见肺部转移或全身弥漫性转移后死亡。最近几年随着化疗技术发展，骨肉瘤患者生存率得到明显提升，生存时间延长。但化疗伴有严重毒副作用，且化疗耐药影响化疗效果。多药耐药是指肿瘤细胞被一种药物诱发耐药后，同时对其他多种结构和作用机制完全不同的药物产生交叉耐药的一种现象。化疗多药耐药是一个多基因参与的复杂过程[5]。以往研究结果显示[6]，癌细胞对化疗药物的敏感性决定了抗癌小幅。因此，迫切需要寻找理想的肿瘤标志物，以提升化疗效果。MiRNA的前身是初级转录RNA，初级转录RNA在细胞核内被一类多蛋白复合体切除miRNA前体[7-9]。在特异性酶作用下解旋呈单链状态后具有了生物活性，能与靶mRNA上的miRNA依赖性基因沉默复合物结合，通过识别并与非翻译区结合，从而抑制mRNA的翻译。miR-34家族成员较多，其中miR-34a备受关注[10]。目前已研究证实[11-12]，肿瘤细胞中的染色体杂合性缺失和启动子区域的GpG岛甲基化导致了miR-34a表达量的异常，而其通过多种下游靶分子参与了调节肿瘤细胞的生物学特征[13]，包括肿瘤增殖与凋亡等。miR-449a是最近几年来新发现的一种miRNA，能通过转录后调控的方式来调控多种基因表达，直接或间接参与某些疾病的发生和发展[14]。miR-449a能上调p53的表达，间接激活p21基因，在PARP与其他细胞凋亡相关蛋白参与下，最终有道细胞程序性凋亡，其表达上调能进一步抑制癌细胞政增殖和促进癌细胞程序性死亡[15]。

由于循环miRNA可以在血液中稳定表达，并具有无损伤，可以多次反复取材检查的优点，因而现已广泛用于各种癌症的检查和判断预后[16]。在指导临床诊治上，miRNA具有很广阔的前景[17-19]。本文纳入分析了83例骨肉瘤患者和83例体检健康的受试者，对其血清miR-34a、miR-449a表达水平进行比较，结果显示骨肉瘤研究组患者miR-34a高表达，而miR-449a低表达。说明，骨肉瘤患者血清miR-34a、miR-449a表达情况异于同龄健康人群。进一步分析发现，不同肿瘤大小、分期患者的血清miR-34a、miR-449a水平存在差异，其中>19岁、肿瘤直径>10cm和Ⅲ期分期患者的血清miR-34a水平最高，而miR-449a水平最低。提示，骨肉瘤患者年龄、肿瘤直径、分期影响血清miR-34a、miR-449a表达。患者经新辅助化疗治疗后，出现63.56%(52/83)的化疗无效现象，说明存在一定程度的化疗耐药情况[20]。化疗有效组患者血清miR-34a表达水平明显低于无效组，miR-449a表达水平明显高于化疗无效组。提示miR-34a高表达和miR-449a低表达可能影响骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性，高表达miR-34a和低表达miR-449会增强癌细胞对多种化疗药物产生耐受，进而降低细胞对化疗的敏感性。

综上所述，骨肉瘤患者血清miR-34a高表达，miR-449a低表达，并协同参与影响新辅助化疗耐药。