非小细胞肺癌中Cx43蛋白表达水平及其临床意义

史 册 张伟华 刘艳梅

肺癌属于临床常见恶性肿瘤，据统计，肺癌中80%以上属于非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，早期 NSCLC患者术后5年总生存率可达86%，然而肺癌早期诊断较为困难，大部分NSCLC确诊时已到晚期阶段，5年生存率甚至在10%以下[1]。缝隙连接是细胞间信息交换重要通道，缝隙连接细胞间通讯在组织生长、组织器官内细胞间协调稳定维持等诸多方面均具有重要作用[2]。缝隙连接蛋白(connexin,Cx)是由连接蛋白基因编码的一组蛋白质，作为缝隙连接基础结构参与细胞生长到死亡全部过程，包括生长、发育、增殖、分化、代谢和内环境稳定维持等[3]。Cx43属于间隙连接蛋白家族主要成员，主要在心肌组织、成纤维细胞、上皮细胞等中表达，可作为缝隙连接结构与功能基础[4]。细胞缝隙连接蛋白的表达水平则提示细胞间通迅功能强弱，如细胞缝隙连接蛋白少则提示该细胞功能较独立或缺乏信息交通，所以Cx表达异常所致的细胞缝隙连接功能缺陷可能和多种肿瘤恶性增殖与转化相关[5]。基于此，本研究分析NSCLC患者癌组织Cx43表达水平，分析其表达与疾病临床病理、转移及预后的关系，旨在为临床的早期诊断、治疗及预后判断提供分子学依据，报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取本院2013年12月至2017年12月收治的NSCLC行手术治疗的患者76例，其中男性42例，女性34例；年龄41～79岁，平均(65.81±6.47)岁；吸烟史：有29例，无47例；病理类型：鳞癌57例，腺癌19例；TNM分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期30例，Ⅲ期27例；淋巴结转移：无42例，有34例。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①临床组织学或细胞学确诊为NSCLC；②可接受随访；③经医院伦理委员会批准，患者及家属知情同意。排除标准：①合并其他部位或肿瘤类型；②合并骨髓、血液、免疫疾病；③合并心脑血管疾病；④合并严重感染；⑤近3个月内接受过放化疗或外科手术。

1.3 检测方法

标本4 μm厚连续切片，60 ℃条件烘烤20 min，二甲苯脱蜡后梯度酒精连续脱水，PBS清洗(3次)，去离子水冲洗，室温下，3%H2O2阻断10 min，PBS清洗(3次)，抗原热修复，PBS清洗(3次)。浸于10%的BSA中，室温下孵育5 min，非特异性位点封闭，加一抗，4 ℃孵育，PBS清洗(3次)。滴加HRP标记SP，43 ℃孵育30 min，PBS清洗(3次)，DAB显色 10 min，PBS清洗，苏木精溶液复染，盐酸酒精分化，脱水10 min，封片观察。

1.4 染色结果判断

由两位病理科医师通过光学显微镜分析切片各位点，确定蛋白表达，阅片者均在对研究对象一般资料不了解的前提下独立阅片和分析，对于判定结果意见存在分歧的切片，协商讨论达成一致。高倍镜下选取5个视野，保证每一视野中可观察到的细胞数在200个以上，Cx43阳性表达定位于细胞质和细胞膜，依阳性细胞染色强度与比例判定Cx43蛋白表达结果[6]：着色程度：无(0分)，淡黄(1分)，棕黄(2分)，棕褐(3分)；阳性细胞比例：阴性(0分)，1%～25%(1分)，>25%～50%(2分)，>50%～75%(3分)，>75%～100%(4分)；染色分级为着色程度与阳性细胞比例乘积，<6分为低表达，≥6分代表高表达。

1.5 统计学方法

采用SPSS20.0，计数资料以例数与率(%)表示，组间采用χ2检验比较；采用Logistic回归分析影响Cx43蛋白在NSCLC癌组织中的表达水平的因素，通过Kaplain-Maier方法描绘生存曲线，计算Cx43蛋白高表达与低表达患者生存率，并用Log-rank检验，P<0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cx43蛋白在NSCLC癌组织中的表达

NSCLC癌组织中Cx43蛋白高表达率为35.53%(27/75)，低于癌旁组织的76.32%(58/76)(χ2=25.649，P<0.05)。

2.2 NSCLC癌组织中Cx43蛋白表达与临床病理特征参数的关系

性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、病理类型与NSCLC患者癌组织中Cx43蛋白表达水平无关(P>0.05)；低分化、临床分期Ⅲ期、发生淋巴结转移患者Cx43蛋白高表达率均低于中高分化、临床分期Ⅰ期或Ⅱ期、未发生淋巴结转移患者(P<0.05)。见表1。

表1 NSCLC癌组织中Cx43蛋白表达与临床病理特征参数的关系/例

2.3 影响NSCLC癌组织中Cx43蛋白表达的Logistic回归分析

将上述因素差异有统计学意义项纳入多因素Logistic回归模型，以Cx43蛋白表达作为因变量，Cx43蛋白(高表达=0，低表达=1)，以上述差异有统计学意义项作为自变量，并进行赋值，分化程度(高分化=0，中分化=1，低分化=2)、临床分期(Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2)、淋巴结转移(未发生=0，发生=1)，Logisitic回归分析显示分化程度低、临床分期高、发生淋巴结转移是导致Cx43蛋白低表达的独立危险因素。见表2。

表2 影响NSCLC癌组织中Cx43蛋白表达的Logistic回归分析

2.4 NSCLC癌组织中Cx43蛋白表达与生存时间的关系

随访3年，根据患者随访情况，绘制3年无进展生存曲线和总生存曲线，如图1、图2。Cx43蛋白高表达者3年无进展生存率与总生存率分别为：66.67%(18/27)、77.78%(21/27)，高于Cx43蛋白低表达者的42.86%(21/49)、51.02%(25/49)(P<0.05)。

图1 3年无进展生存分析

图2 3年总生存分析

3 讨论

肺癌大多数起源于支气管黏膜或腺体，因此又被称为原发性支气管肺癌，是全球发病率与死亡率相对较高的癌症类型。肺癌病因较多，包括吸烟、职业暴露、空气污染、饮食不良以及遗传易感性等。近年来，NSCLC发病率增加，且以老年人群为主，NSCLC癌细胞生长分裂速度较为缓慢，扩散转移一般较晚，因为早期患者症状一般不明显[7]。

相邻细胞间信息与能量物质交换对于细胞新陈代谢、增殖、分化等生理过程均十分重要，该过程主要通过细胞间间隙连接通讯实现[8]。间隙连接通讯结构与功能异常参与多种疾病尤其是肿瘤的发生与发展。间隙连接普遍存在于动物组织中，位于细胞相邻面，是相邻细胞沟通的跨膜通道。目前哺乳动物连接蛋白家族包括 21种跨膜蛋白，依据家族基因编码蛋白质分子量命名，如Cx26、Cx32、Cx43等[9]。近年来研究表明[10]Cx在大多数肿瘤细胞中表现为降低甚至缺失，而其周围毗邻正常细胞缝隙连接蛋白功能正常，Cx表达上调或缝隙连接蛋白功能改善可抑制肿瘤发生或逆转其表型。Cx43属于抑癌基因，和恶性肿瘤的发生关系密切，恶性肿瘤Cx基因抑制，常处于失活状态，随Cx43表达下降和缺失，可导致连接通信功能减退，细胞间信号传递、增殖分化受到影响，导致人体内环境紊乱，肿瘤细胞恶性演变[11]。

Liu G等[12]研究发现，基因转染技术诱导Cx 基因表达后可明显抑制转化细胞生长及肿瘤形成。相关研究表明，Cx43异常表达与肾脏肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫平滑肌肉瘤、前列腺癌等的发生发展有关。本研究中NSCLC患者癌组织Cx43高表达率低于癌旁组织，表明Cx43蛋白表达率降低也是NSCLC发生的原因之一。在肿瘤细胞中，Cx43 表达的降低或缺失使细胞间通讯出现异常，机体对细胞的监视与调控力减弱，细胞过度克隆生长，Cx43表达升高促进间隙连接蛋白组装，增加细胞间信号交流，控制细胞之间的生长[13]。郭爱萍等[14]研究利用免疫组织化学法发现，Cx43染色强度及阳性率随肺癌分化程度下降而呈现出降低趋势。本研究进一步分析Cx43蛋白表达水平与NSCLC临床病理特征的关系，结果显示Cx43蛋白表达水平与鳞癌和腺癌病理类型以及肿瘤大小无相关性，但与癌组织分化程度、临床分期、淋巴结转移均有一定的关系，Cx43蛋白表达随着分化程度降低、临床分期增高、淋巴结转移，Cx43在NSCLC癌组织中的表达呈降低趋势，提示Cx43蛋白可能参与NSCLC的进展。Cx43通过细胞间连接的稳定性维持，参与到细胞增殖调控、凋亡及细胞间信号和刺激传递等，使肿瘤细胞重新恢复细胞连接通讯，达到抑制肿瘤发展的目的[15]。本研究对76例NSCLC患者3年生存率进行分析，应用Kaplan-Meier法分析Cx43蛋白表达水平与NSCLC预后之间的相关性，结果显示NSCLC癌组织中Cx43蛋白低表达的患者，其3年总生存率与无进展生存率均低于Cx43蛋白高表达者，说明Cx43蛋白表达水平与NSCLC患者生存时间有关，Cx43蛋白表达水平可被用作判断 NSCLC患者预后的指标。

综上所述，Cx43蛋白在NSCLC癌组织中的表达下调，与NSCLC的发生及组织分化程度、临床分期、淋巴结转移相关，Cx43蛋白表达是NSCLC 患者总生存期的预后生物分子标志物，Cx43蛋白低表达可预示患者不良预后。