糖尿病视网膜病变患者CD4+CD25+Foxp3+Treg与VCAM-1、ICAM-1的变化及意义*

孙 娜，何明海，杨文翔，李雪璐

(1.四川省南充市中心医院内分泌科 637000；2.川北医学院微生物学与免疫学教研室,四川南充 637000)

据国际糖尿病联盟(international diabetes federation,IDF)的数据显示，2014年全世界有 3.87亿糖尿病患者。预计至2035 年，糖尿病患病人数将达到6亿[1-3]。我国是全球糖尿病患者人数最多的国家，据2013年IDF统计数据，我国20～79岁糖尿病患者为0.98亿，预计至2035年将增至1.43亿[4-5]。国内的1项研究报道了2007年6月至2008年5月的大样本抽样调查结果，我国糖尿病及糖尿病前期患者人数分别为0.92亿和1.48亿；而2010年的流行病学调查显示分别增至1.14亿和4.93亿，由此可见我国面临着巨大的糖尿病预防和治疗压力[6]。视网膜病变是糖尿病患者最常见的并发症之一，其发病因素与高血糖对血管壁的损伤及免疫因素密切相关，而免疫因素在近年来越来越被研究者们认可，但具体的发病机制尚不十分清楚。CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(CD4+CD25+Foxp3+Treg)在免疫系统调节过程中扮演着重要的角色，有研究报道称CD4+CD25+Foxp3+Treg有助于减少牛奶蛋白过敏的发生，并帮助诱导免疫耐受[7]。而CD4+CD25+Foxp3+Treg的改变会影响机体的炎性反应，改变细胞血管黏附分子-1(VCAM-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达[8]。亦有研究表明，糖尿病视网膜病变患者VCAM-1和ICAM-1的表达会显著上调[9]。但其参与糖尿病视网膜病变发生发展的机制尚无研究报道，本研究拟收集并分析糖尿病视网膜病变患者CD4+CD25+Foxp3+Treg与VCAM-1、ICAM-1的变化并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性收集并分析四川省南充市中心医院2017年10月至2019年5月收治的112例糖尿病视网膜病变患者设为观察组，其中男65例，女47例；平均年龄(44.56±10.05)岁；病程2～7年，平均(3.92±1.13)年。同期选择糖尿病而无视网膜病变患者112例设为对照组，其中男58例，女54例；平均年龄(45.08±11.21)岁；病程1～7年，平均病程(3.68±0.91)年。观察组和对照组患者平时血压控制良好，无高血脂、冠状动脉粥样硬化性心脏病等心血管并发症。2组患者的纳入标准：(1)所有糖尿病患者均符合WHO推荐的2型糖尿病的诊断标准；(2)观察组患者的糖尿病视网膜病变分期为Ⅳ～Ⅵ期；(3)所有患者及家属均知情同意，签署知情同意书。排除标准：(1)1型糖尿病及继发性糖尿病患者；(2)近期使用(口服或静脉注射)免疫抑制剂或糖皮质激素者；(3)眼部具有疾病史者；(4)近期具有感染史者；(5)具有肿瘤等消耗性疾病者。选取2017年10月至2019年5月门诊体检的112例健康志愿者设为空白组，其中男62例，女50例，平均年龄(45.69±12.36)岁，纳入标准：无高血压、糖尿病、高血脂及其他慢性病史，近期无感染史及眼部疾病史。本研究得到了南充市中心医院伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1标本的采集与分离

使用真空抗凝采血管采集所有研究对象的晨起静脉血约5 mL×3管，PBS洗涤后制成单核细胞悬液。另取单核细胞悬液150 μL，向其中分别加入15 μL FITC标记的CD4单克隆抗体(RM-4，货号：45-0042-82，美国eBioscience公司)与PE标记的CD25单克隆抗体(PC61.5，货号：17-0251-82，美国eBioscience公司)，避光后室温放置0.5 h，之后加入2 mL 事先预冷的 PBS，离心机1 000 r/min震荡洗涤5 min，随后加入1 mL的破膜剂(货号：A24261，美国eBioscience公司)，1 h后加入透膜缓冲液(规格：00-19001，美国eBioscience公司)，10 min后离心重悬，紧接着加入10 μL PE-Cy5标记的Foxp3抗体(PCH101，货号：35-4776-41，美国eBioscience公司)，避光后室温放置0.5 h，之后加入2 mL 事先预冷的PBS，离心机1 000 r/min震荡洗涤5 min，然后加入500 μL的PBS重悬。

1.2.2空腹血糖(FBG)及糖化血红蛋白(HbA1c)检测

取清晨空腹外周静脉血5 mL，采用葡萄糖氧化酶法测定血清FBG水平，试剂盒购自浙江蓝森生物科技有限公司；采用高效液相离子层析分析仪(美国安捷伦科技公司)检测HbA1c水平。

1.2.3全自动生化分析仪检测C反应蛋白(CRP)水平

取清晨空腹外周静脉血5 mL，3 500 r/min(离心半径7.5 cm)离心20 min，取上清液，血清CRP水平采用7600-020型全自动生化仪(日本日立公司产品)测定。

1.2.4流式细胞术检测CD4+CD25+Foxp3+Treg

采用Coulter Epics XL 流式细胞仪(美国Beckman公司)对各组悬液进行细胞计数。在FSC-SSC点图上选定淋巴细胞群选项，分析CD4+CD25+T细胞内 Foxp3的表达情况。根据同型对照中的阴性细胞确定Foxp3空白和阳性阈值，以此阳性阈值求得测定管的Foxp3在CD4+CD25+T细胞的阳性率。

1.2.5ELISA法检测VCAM-1和ICAM-1的表达水平

采用ELISA试剂盒分别检测血清VCAM-1(批号：ab47355，英国Abcam公司)和ICAM-1(批号：ab174445，英国Abcam公司)的表达水平。所有的操作流程均按照试剂盒说明书要求严格执行。具体步骤如下：室温下从密封袋中取出实验所需板条，事先预留空白孔，分别将标本血清和不同浓度的试剂标准品置于相应孔中(100微升/孔)，密封板孔后置于烤箱37 ℃反应60 min。密封避光保存，洗板机洗板3次,每次15 min，加入TMB显色工作液(包括空白孔)每孔100 μL，置于37 ℃保温箱避光孵育，待各板孔出现梯度颜色时即可加入终止液，每孔100 μL，根据样品吸光度(A)值计算样本浓度。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 3组患者的一般资料比较

3组患者年龄、腰臂比(WHR)比较，差异无统计学意义(P>0.05)；观察组及对照组BMI、FPG和HbA1c水平与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而观察组与对照组BMI、FPG和HbA1c水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 3组患者的一般资料比较

2.2 3组患者血清细胞检测结果

3组患者IgE水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；观察组和对照组CD4+CD25+Foxp3+Treg阳性率均低于空白组，CRP水平均高于空白组，且观察组CD4+CD25+Foxp3+Treg阳性率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；观察组CRP水平与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 3组VCAM-1和ICAM-1表达水平比较

观察组和对照组患者VCAM-1和ICAM-1表达水平均高于空白组，且观察组VCAM-1和ICAM-1表达水平均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表2 3组患者血清细胞检测结果

表3 3组VCAM-1和ICAM-1表达水平比较

3 讨 论

糖尿病视网膜病变是糖尿病常见的十分严重的微血管并发症之一，是导致视力丧失的主要原因[10-12]。糖尿病视网膜病变是糖尿病代谢紊乱和内分泌系统与血液系统损害在视网膜上的综合反映，其发病率随糖尿病病程的发展而增高，40岁以上糖尿病患者，大约有40%存在视网膜病变，大约8.2%存在视力损伤[13-14]。而在临床实践中发现，许多患者在发现糖尿病视网膜病时，已经错失了预防性治疗的最佳时机，因此及时准确地给予治疗，对于挽救患者视力，提高其生活质量具有极其重要的意义。

CD4+CD25+Treg是1995年SAKAGUCHI等[15]发现的对免疫反应有重要调控功能的T 细胞亚群，通过主动调节的方式抑制存在于正常机体内潜在的自身反应性T细胞的活化与增殖，并识别自身抗原肽和分泌抑制因子；而CD4+CD25+Foxp3+Treg表达多种表面分子，其中Foxp3+是目前公认的CD4+CD25+Foxp3+Treg的特异性标志物[16-18]。本研究结果显示，观察组和对照组CD4+CD25+Foxp3+Treg阳性率均低于空白组，CRP水平均高于空白组，且观察组CD4+CD25+Foxp3+Treg阳性率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明糖尿病视网膜病变患者的CD4+CD25+Foxp3+Treg明显低于糖尿病无视网膜病变患者。原因可能是患者CD4+CD25+Foxp3+Treg减少从而损伤视网膜，与既往报道较为一致[18]。

VCAM-1是一类与动脉粥样硬化密切相关的黏附分子。在许多疾病病理过程中，VCAM-1有利于炎症细胞浸润到局部组织，炎症反过来又促进组织新生血管生成化[19- 20]。本研究结果显示观察组和对照组患者VCAM-1和ICAM-1均高于空白组，且观察组VCAM-1和ICAM-1水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。该结果说明VCAM-1和ICAM-1的表达在糖尿病患者血清中表达水平较高，而在糖尿病视网膜病变患者中表达水平更高，与本研究预期相符，临床上在糖尿病治疗的过程中应给与重视，定期检测血清CD4+CD25+Foxp3+Treg数量及VCAM-1和ICAM-1的表达水平，为明确病因和患者的早期诊疗提供可靠的实验依据。但其具体的机制尚不明确，需进一步研究探索。

综上所述，糖尿病视网膜病变的发生与CD4+CD25+Foxp3+Treg及VCAM-1和ICAM-1的表达密切相关，临床医生可根据这些指标给予糖尿病患者针对性治疗。