基于网络药理学与生物信息学预测大枣抗焦虑、抗抑郁的潜在活性成分及作用机制

翁小建 谈毅 高秀飞

作为药食两用常见药材，大枣药用历史悠久，《伤寒论》等多部医书均有多处阐述，有补中益气与养血安神之功效[1]。《中华医典》记载治疗抑郁方剂中，使用频次最高的十种复方约半数含大枣，如甘麦大枣、归脾汤、大枣汤与紫苏子汤等[2]。研究表明，甘麦大枣汤等单用或联用可通过调节神经递质、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴及促进脑源性神经营养因子（BDNF）分泌等，有效治疗产后抑郁、乳腺癌合并抑郁以及中风后抑郁等[3]。此外，大枣提取物可促进星形胶质细胞中BDNF 表达水平，拮抗活性氧等自由基对神经细胞的损伤作用，这些证据表明大枣在抗抑郁具有潜在治疗作用[4]。然而，大枣抗焦虑、抗抑郁的活性成分与作用机制并未得到揭示与阐明。因此，本文拟采用网络药理学，结合生物信息预测研究，探索大枣中抗焦虑、抗抑郁潜在的活性成分与分子机制。

1 材料与方法

1.1 构建大枣抗焦虑、抗抑郁活性成分数据库 采用TCMSP（版本2.3）检索大枣的化学成分，根据化合物药代动力学特性，采用口服利用度（OB）大于30%及成药相似性（DL）大于0.18 两项参数，筛选大枣潜在抗焦虑、抗抑郁活性成分。

1.2 构建大枣抗焦虑、抗抑郁活性成分靶标数据库采用TTD 数据库（更新至2020 年6 月1 日），根据上述得到的活性成分，预测与抗焦虑、抗抑郁相关靶标。

1.3 REACTOME 富集分析 采用REAC 数据库（版本75，更新至2020 年12 月25 日），根据上述靶标，预测大枣活性成分REAC 通路。

1.4 g:Profiler 富集分析 采用g:Profiler（版本：e102_eg49_p15_7a9b4d6）根据上述候选靶标，进行GO、KEGG、REAC 和WP 富集分析[5]。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（PPI）和转录因子-miRNA协同调节网络分析 采用NetworkAnalyst（更新至2021 年1 月20 日）[6]根据上述候选靶标，进行PPI 和TF-miRNA 协同调控网络。

1.6 数据统计分析 所有数据均采用数据库默认的参数进行数据统计与分析，以Adjusted P 值（AdjP）或FDR＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗焦虑与抗抑郁活性候选化合物 利用TSMCP 数据库一共检索出133 种化合物（含同分异构体），其中OB＞30%获得52 种，87 种DL＞0.18。合并分析后发现同时达到两项标准共29 种化合物。其中24 种与抗焦虑和抗抑郁无关，5 种化合物与抗焦虑和抗抑郁相关（见表1 和图1A）。采用这5 种化合物从TTD 数据库得到10 个抗焦虑和抗抑郁靶标（见表2）。比如，β-胡萝卜素（beta-carotene）可分别激活5-羟色胺受体2A（HTR2A）、H/ACA 核糖核蛋白复合物亚基（GAR）、钠依赖性血清素转运体（SLC6A4）和γ-氨基丁酸受体亚基α1（GABRA1）发挥抗焦虑作用，激活GAR、SLC6A4、μ 型阿片受体（OPRM1）、γ-氨基丁酸受体亚基γ2（GABRG2）、γ-氨基丁酸受体亚 基β2（GABRB2）、GABRA1 和单胺氧化酶B（MAOB）发挥抗抑郁作用（见图1B）。

图1 大枣中抗焦虑与抗抑郁候选活性成分与靶标网络

表1 大枣抗焦虑与抗抑郁候选活性成分

2.2 REAC 富集结果 采用上述候选靶标从REAC数据库富集到28 条信号通路（P＜0.05）（见图2）。分类统计后发现：这些信号通路基本集中在信号转导、DNA 修复和神经系统，三者之和达到75%（见图2C）。比如，信号转导发现受体蛋白酪氨酸激酶、多巴胺受体、血清素受体、G 蛋白偶联受体和胺配体结合受体等通路；在DNA 修复富集到DNA 损伤与修复通路；在神经系统中富集到γ-氨基丁酸受体激活、突触传递、神经递质受体与突触后信号传递与5-羟色胺从突触间隙中清除等通路（见图2B）。

图2 REAC 富集分析网络

2.3 g:Profiler 富集结果 继续利用候选靶标进行g:Profiler 进行GO 富集分析，共得到623 条显著差异条目，其中包含92 条分子功能（MF）、462 条生物学过程（BP）和69 条细胞定位（CC）（见图3A）。如在分子功能中得到神经递质受体活性，γ-氨基丁酸受体活性等条目；生物学过程富集到组胺反应、突触信号、单胺转运与离子传输等条目；在细胞定位富集分析到突触和质膜等细胞组分（见图3B）。

在KEGG、REAC 和WP 富集分析中，共获得48种显著差异通路，在KEGG、REAC 和WP 中分别得到12 条、19 条和17 条差异通路（见图3A）。KEGG富集分析评分靠前的主要有神经活性配体受体相互作用、5-羟色胺能突触、γ-氨基丁酸能突触、突触囊泡周期、缝隙连接和多巴胺能突触（见图3C）。REAC主要富集分析γ-氨基丁酸受体激活、受体蛋白酪氨酸激酶通路、化学突触传递、胺配体结合受体、神经递质受体与突触后信号传递、生物胺被单胺氧化酶氧化脱氨为醛、突触间隙清除血清素（见图3D）。WP富集分析到脑源性神经营养因子对γ-氨基丁酸神经传递的调节、血清素与焦虑、单胺转运、G 蛋白偶联受体等通路（见图3E）。

图3 g:Profiler 富集结果

2.4 PPIs 网络 随后通过NetworkAnalyst 进行PPIs分析，共发现4 个PPI 亚簇（见图4A）。发现μ 型阿片受体、D（2）多巴胺受体、钠依赖性血清素转运体、单胺氧化酶B 和钠依赖性去甲肾上腺素转运蛋白与其它蛋白存在广泛的相互作用，属于评分靠前关键蛋白（见图4B）。

图4 PPIs 网络与Top10 蛋白

2.5 TF-miRNA 协同调节网络 随后继续采用NetworkAnalyst 进行TF-miRNA 协同网络预测，发现在转录因子TFs、miRNAs 和靶标间存在复杂广泛的调控网络（见图5A）。其中hsa-miR-155 和hsa-miR-203 与PPARG、CREB1、E2F1-7 和SP1 等转录因子共同调控 GABRB2、SLC6A4、OPRM1、GABRA1、SLC6A2、MAOB、HTR2A、GABRG2、DRD2 和PPARG等基因的表达（见图5B）。

图5 TF-miRNA 协同调控网络

3 讨论

抑郁是一种以情绪低落、兴趣减退、快感缺失为主，并伴有一定思维迟缓与认知障碍的身心性疾病。抑郁的发病机制尚不明确，目前主要有HPA、单胺类神经递质与神经元损伤、BDNF 等假说[7]。在焦虑及抑郁发病过程中涉及众多相互关联的神经化学分子，如血清素、γ-氨基丁酸及5-羟色胺等。如5-羟色胺可与谷氨酸、γ-氨基丁酸、G 蛋白偶联受体和单胺氧化酶等相互作用，共同参与抑郁症的发生与发展[7]。此外，抑郁患者体内BNDF 也显著低于健康人群[8]。

文献报道含大枣的方剂，如越鞠甘麦大枣汤等可通过调控PKA -CREB -BDNF、AKT/mTOR 与SIRT1/ERK1/2 等信号通路，调控脑内5-HT 等含量变化，最终发挥抗抑郁作用[9-12]。本文发现，大枣活性成分激活了BDNF 与5-羟色胺等信号通路，这可能是越鞠甘麦大枣汤发挥抗抑郁的作用机制之一。

本文采用TCMSP 数据库检索大枣潜在抗焦虑、抗抑郁活性成分，随后采用TTD 数据库确定潜在作用靶标，并结合g:Profiler 或REACTOME 软件进行REAC、GO、KEGG 和WP 富集分析，最后通过NetworkAnalyst 软件构建PPIs 和TF-miRNA 协同调控网络。初步在大枣中发现5 个潜在抗焦虑、抗抑郁活性成分，如（S）-乌药碱、β-胡萝卜素、β-谷甾醇与千金藤啶碱等。这些成分与抗抑郁均有明确的关系。如（S）-乌药碱可通过调控糖原合成酶激酶-3β、胱硫醚β 合成酶等抑郁症相关靶点调控MAPK、VEGF 与胰岛素信号通路等发挥治疗抑郁症作用[13]。β-胡萝卜素摄入量大的人群，焦虑和抑郁患病率较低，并与压力相关[14]。β-谷甾醇可以通过调控由5-羟色胺、多巴胺和Y-氨基丁酸系统介导的信号通路发挥抗抑郁作用[15]。通过本研究筛选得到的活性成分可以发挥抗抑郁作用，表明本文研究方法的可靠性。

综上所述，大枣可以通过调节hsa-miR-155 和hsa-miR-203 等miRNAs 与PPARG、CREB1、E2F1-7和SP1 等转录因子的表达，并调控GABRB2、SLC6A4、OPRM1、GABRA1、SLC6A2、MAOB、HTR2A、GABRG2、DRD2 和PPARG 等基因的表达，可能最终激活脑源性神经营养因子、血清素受体、γ-氨基丁酸、5-羟色胺、G 蛋白偶联受体和受体蛋白酪氨酸激酶等信号通路，影响了神经递质释放与传递，最终起到抗焦虑、抗抑郁作用。