介藜芦碱调控miR-132-3p/FOXN3 轴抑制胃癌细胞迁移、侵袭机制研究

吴亚萍 马君

胃癌是最常见的消化道肿瘤之一，其检出率位居全球第五，死亡率仅次于肝癌和肺癌[1]。在中国，胃癌的发生率及死亡率均高于世界平均水平[2]。近年癌症的治疗手段不断发展，但还是以手术治疗为主。多数癌症患者在诊断时已发生癌细胞的转移，患者的中位生存期约为1年[1，3]。化疗是中晚期癌症患者的主要治疗手段，但因化疗药物毒性及耐药而大大限制了其临床应用和疗效[4]。上皮-间质转化（epithelial mesenchymal tran-sition，EMT）是上皮细胞转化为间质细胞的生物过程，发生转化的细胞具有侵袭性和迁移能力，肿瘤细胞的EMT 能力决定了多种类型的肿瘤恶性进展[5]。研究表明，EMT 是胃癌发生转移的关键因素之一。介藜芦碱是中药藜芦的重要单体成分，可以通过抑制非小细胞肺癌PI3K-AKT 信号促进细胞自噬的发生，从而抑制肺癌恶性进程[6-7]。然而其在胃癌中的作用尚未见报道，本研究将探讨介藜芦碱对胃癌的作用及相关机制。

1 实验材料

1.1 细胞株 人胃癌细胞系NCI-N87（批号CL-0169）购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 试剂 RPMI 1640 培养基（批号31800022）、胎牛血清（批号16000-044）购于美国Gibco 公司。Edu 细胞增殖检测试剂盒（批号C0085S）、结晶紫（批号C0121）购于上海碧云天生物技术有限公司。Transwell 小室（批号3412）购自美国corning 公司。Trizol 试剂购于上海普飞生物科技有限公司。miRNA逆转录试剂盒（批号638315）、定量PCR 试剂盒（批号RR820A）购于日本Takara 公司。一抗（E-cadherin、Vimentin、ZO-1、β-actin 批号分别为3195、5741、13663、3700）均购于美国CST 公司，细胞免疫荧光二抗（批号A-21072）购于美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 仪器 Ti-E 型荧光显微镜（日本尼康公司）；A1 HD25 型共聚焦显微镜（日本尼康公司）；BIORADXR 型成像仪（美 国 Bio -Rad 公 司）；LightCycler480Ⅱ型荧光定量PCR 仪（Roche 公司）。

2 实验方法

2.1 细胞培养 将NCI-N87 细胞铺板于96 孔板中，根据介藜芦碱浓度不同，分为对照组（1%DMSO）、低剂量组（10μg/mL）和高剂量组（30μg/mL）。每组5 个复孔。将药物按照上述剂量加入到对应细胞中过夜培养，并按试剂盒使用说明书操作。Ti-E 型荧光显微镜下观察拍照，利用image J 软件统计Edu阳性率。

2.2 细胞迁移以及侵袭实验 细胞迁移分为对照组（%DMSO）、低剂量组（10μg/mL）、高剂量组（30μg/mL），每组3 个复孔。药物处理24h 后，消化细胞，离心，无血清培养基重悬细胞，将NCI-N87 细胞加入Transwell 上室。24h 后细胞取出，用棉签将上室细胞拭去，显微镜下观察结晶紫染色，拍照后利用image J 统计迁移细胞数。在Transwell 膜上涂抹基质胶各组进行侵袭实验。

2.3 细胞免疫荧光 实验分组同上，将各组NCIN87 细胞铺板于24 孔板细胞爬片上，药物处理24h后，加入一抗、二抗孵育，对NCI-N87 细胞进行DAPI染色。使用共聚焦显微镜观察拍照。

2.4 蛋白免疫印记 实验分组同上，各组细胞铺板于6 孔板中，经过药物处理24h 后，利用1×loading 直接裂解NCI-N87 细胞蛋白，制作电泳样品。经过电泳-转膜封闭后，进行一抗、二抗孵育。加入化学反应底物，利用成像仪进行成像分析。实验进行3 次独立重复。

2.5 定量PCR 实验分组同上，各组细胞铺板于6孔板中，药物处理24h 后，trizol 提取NCI-N87 细胞RNA，RR036A、RR037A 试剂盒逆转录mRNA 及miRNA。定量PCR 试剂盒检测NCI-N87 细胞RNA表达水平。相关特异性引物序列如下：FOXN3：F-5'-ACTCTGACATGCCCTACGATG-3'，R-5'-TCTGACTCCTCTCTTTGTCCAC-3'；miR-132-3p：F-5'-CCAGCATAACAGTCTACAGCC-3'，R-5'-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3'；U6：F-5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R-5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。GAPDH 及U6 分别为mRNA 及miRNA 的内参。以上引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。反应体系置于LightCycler480Ⅱ型荧光定量PCR 仪中检测。

2.6 统计学方法 应用SPSS 22.0 对实验数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组均数间比较行单因素方差分析，两组之间比较采用LSD 检验，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 介藜芦碱对胃癌细胞增殖的影响 细胞增殖检测结果显示，介藜芦碱低、高剂量组胃癌细胞Edu 阳性细胞数与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

图1 Edu 检测介藜芦碱对胃癌细胞NCI-N87 增殖的影响（400×）

3.2 介藜芦碱抑制胃癌细胞迁移、侵袭 介藜芦碱处理胃癌细胞24h 后，发现介藜芦碱可以明显抑制胃癌细胞的迁移和侵袭，并呈现剂量依赖性，低剂量即可减少胃癌细胞侵袭和迁移的数量，而高剂量效果更加显著（见图2）。统计侵袭和迁移的细胞数并计算相对迁移率和侵袭率结果显示，与对照组比较，介藜芦碱低、高剂量组胃癌细胞NCI-N87 的迁移率和侵袭率均显著降低（P 均＜0.05）。见表1。

图2 介藜芦碱对胃癌细胞迁移和侵袭的作用（结晶紫染色400×）

表1 介藜芦碱对胃癌细胞相对迁移率和侵袭率的影响（%，）

表1 介藜芦碱对胃癌细胞相对迁移率和侵袭率的影响（%，）

注：对照组为NCI-N87 细胞未经处理；低剂量组为10μg/mL 介藜芦碱处理组；高剂量组为30μg/mL 介藜芦碱处理组；与对照组比较，aP＜0.05

3.3 介藜芦碱抑制胃癌细胞EMT 过程 细胞免疫荧光染色发现，与对照组比较，介藜芦碱低、高剂量组胃癌细胞NCI-N87 中E-cadherin 表达水平显著升高（见图3A）。蛋白免疫印迹实验发现，与对照组比较，低、高剂量介藜芦碱促进胃癌细胞NCI-N87 E-cadherin 蛋白表达，降低Vimentin、ZO-1 蛋白表达水平（见图3B），灰度统计结果显示，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

图3 介藜芦碱对E-cadherin、Vimentin、ZO-1 表达的影响

表2 介藜芦碱对E-cadherin、Vimentin、ZO-1 蛋白表达的影响（）

表2 介藜芦碱对E-cadherin、Vimentin、ZO-1 蛋白表达的影响（）

注：对照组为NCI-N87 细胞未经处理；低剂量组为10μg/mL 介藜芦碱处理组；高剂量组为30μg/mL 介藜芦碱处理组；与对照组比较，aP＜0.05

3.4 介藜芦碱调控胃癌细胞miR-132-3p/FOXN3轴 与对照组比较，介藜芦碱低、高剂量组胃癌细胞miR-132-3p 表达明显降低，其靶基因FOXN3 表达明显增加，差异有统计学意义（P 均＜0.05）。见表3。

表3 介藜芦碱对胃癌细胞miR-132-3p 和FOXN3 mRNA相对表达量的影响（）

表3 介藜芦碱对胃癌细胞miR-132-3p 和FOXN3 mRNA相对表达量的影响（）

注：对照组为NCI-N87 细胞未经处理；低剂量组为10μg/mL 介藜芦碱处理组；高剂量组为30μg/mL 介藜芦碱处理组；与对照组比较，aP＜0.05

4 讨论

介藜芦碱是从藜芦中分离出的天然甾体生物碱。研究表明，其可以抑制人骨髓增生异常细胞的增殖并促进其凋亡，从而减轻骨髓增生异常综合症[8]。同时研究发现，介藜芦碱可以通过诱导自噬来抑制人肝细胞癌的进展[9]。

胃癌细胞恶性增殖以及转移是导致胃癌恶性进展的主要原因。本研究首先检测了介藜芦碱对胃癌细胞的增殖影响，利用不同剂量的介藜芦碱处理胃癌细胞，对其细胞增殖并无影响。因此，我们进一步探讨了介藜芦碱对胃癌细胞迁移及侵袭的影响，研究结果显示，介藜芦碱对胃癌细胞NCI-N87 的迁移和侵袭有明显的抑制作用。

EMT 是肿瘤细胞获得高转移和侵袭能力的关键过程[10]。发生时E-cadherin 下降，而Vimentin、ZO-1表达上调[11]。检测介藜芦碱对E-cadherin、Vimentin及ZO-1 表达的影响，结果发现，低、高剂量的介藜芦碱均能够上调E-cadherin 表达、降低Vimentin 与ZO-1 的表达。提示介藜芦碱对胃癌细胞迁移、侵袭的抑制作用可能是通过调控EMT 相关蛋白的表达发挥作用的。

胃癌是一种上皮源性肿瘤，主要的转移机制是EMT 过程的转变，随着癌细胞的不断增殖，癌灶越来越大，逐渐侵犯富含淋巴管的黏膜肌层和下层，部分胃癌细胞脱落原发灶转移至毛细淋巴管周围，与淋巴管内皮细胞紧密黏附，进入淋巴管腔，达到淋巴结，形成远端转移[12]。本研究结果显示，介藜芦碱可以明显抑制胃癌细胞的EMT 行为，这将极大限制胃癌远端转移的可能性。

miRNA 是由21～25 个核苷酸组成的一类非编码RNA，参与基因调控[13]。miRNA 在胃癌的治疗、诊断及预后方面具有重要意义[14-15]。已知miR-132-3p 在多种肿瘤中发挥重要作用，并有可能作为早期检测肿瘤发展、进展和转移的预后标志物[16]。检测介藜芦碱处理后miR-132-3p 的表达，结果显示，介藜芦碱可降低miR-132-3p 的表达而增加其靶基因FOXN3的表达。因此，介藜芦碱可能通过影响miR-132-3p及靶基因FOXN3 的表达，抑制胃癌EMT 进程，降低胃癌的迁移、侵袭能力。