人参皂苷Rg1 对发育期癫痫模型大鼠认知功能的影响

李慧 陈李兰 李蕊 戴园园

癫痫是常见的神经系统疾病，小儿发病率尤高。长期反复癫痫发作可导致不同程度的认知功能障碍，约1/3 癫痫患者合并认知功能障碍[1]。研究发现，癫痫患者的起病年龄与其认知功能损害程度呈负相关，即起病年龄越小对其认知功能的损害就越大，尤其反映在精神运动方面。已有研究证实，神经限制性沉默因子（NRSF）与人类的认知功能有相关性，且NRSF 与受其调控的基因在对人类认知功能的影响上有联合作用[2-3]。miR-124 为神经元特异性miRNA，与NRSF 相互作用共同调控神经系统的发育[3]。人参皂苷Rg1（ginsenoside Rg1）是人参的主要活性成分之一，具有营养神经及神经保护作用[4-6]。谷氨酸类似物红藻氨酸（kainic acid，KA），为制作癫痫模型常用药[7]。本研究应用KA 制作慢性癫痫模型幼鼠，通过行为学、海马内NRSF 及miR-124 的表达及海马结构的改变，研究人参皂苷Rg1 对慢性癫痫模型幼鼠的影响及机制。

1 实验材料

1.1 动物 50 只健康14d 龄清洁级SD 大鼠，雌雄不限，由徐州医科大学实验动物中心提供，体质量（20.0±3.0）g。在室温（22±2）℃，湿度50%，12h 光/暗循环（早上8：00 亮）下，自由获得食物和水。所有动物实验均经徐州医科大学动物伦理和使用委员会审核批准（编号：2015-46，2015-47），动物合格证号：20200910，动物许可证号：SYXK（苏）2020-0048。

1.2 主要试剂 KA（K0250，美国Sigma 公司）；兔抗鼠NRSF 抗体（PAB9358，北京博奥森生物技术有限公司）；碱磷酶标记山羊抗兔IgG（ZF0308，北京中杉金桥）；Morris 水迷宫（ACT-200A，Coulbourn 公司）；人参皂苷Rg1（GR-133-140620，上海源叶生物科技有限公司）；SYBR Green 染料试剂盒（qPCR001，天根生化科技有限公司），NRSF 引物、miR-124 引物及β-actin 引物（上海生工生物工程有限公司）。

2 实验方法

2.1 分组 50 只大鼠按随机数字表法分为对照组（NS）、模型组（KA）、人参皂苷Rg1 低剂量组（人参皂苷Rg1 10mg/kg 组）、中剂量组（人参皂苷Rg1 30mg/kg）和高剂量组（人参皂苷Rg1 60mg/kg），每组10 只。

2.2 造模及给药 模型组和人参皂苷Rg1 组大鼠称体质量后，给予KA 10mg/kg 腹腔注射。注射KA后1～3mim 开始出现癫痫发作，按照Lado 幼鼠癫痫发作分级标准[8]：0 级为无发作；1 级为机械性咀嚼；2级为连续性点头；3 级为单侧前肢阵挛；3.5 级为前肢交替阵挛；4 级为双侧前肢阵挛、后退；5 级为双侧前肢阵挛、后退、摔倒；6 级为狂奔嘶叫；7 级为强直发作（癫痫发作达5 级以上并出现癫痫持续状态（status epilepticus，SE）且21d后出现自发性反复惊厥（spontaneous recurrent seizure，SRS）的癫痫模型大鼠视为造模成功，对照组大鼠腹腔注射相同体积的生理盐水。治疗组于造模成功后行Morris 水迷宫实验检测大鼠学习、记忆能力有无损害，后分别给予人参皂苷Rg1 10、30、60mg/kg，每天1 次，灌胃治疗30d。再行Morris 水迷宫实验检测大鼠学习、记忆能力有无改善，最后将所有大鼠断头取脑并分离双侧海马，采用RT-qPCR 法检测NRSF mRNA 及miR-124 的表达。用Western blot 法检测蛋白的表达，尼氏染色（Nissl 染色）检测海马结构的病理改变。

2.3 Morris 水迷宫测定SD 幼鼠学习记忆功能（1）定位航行实验（place navigation task）：历时6d，每天4 次，将大鼠分别从4 个象限放入水中，记录90s内寻找平台所需要的时间,找到平台后休息10s，如果90s 内找不到平台，则逃避潜伏期计为90s，并帮助其找到平台并在上面休息10s。（2）空间探索实验（spatial probe test）：用于测量大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的能力。即在训练第7d 撤除平台，将大鼠从距离平台最远的象限作为入水点面向池壁放入水中，记录90s 内大鼠的游泳轨迹和目的象限游泳的时间。实验期间迷宫内外参照物保持不变，迷宫上方安装摄像机，计算机自动记录游泳轨迹和时间。

2.4 Western blot 法检测海马NRSF 蛋白表达 提取海马组织总蛋白，BCA 试剂盒进行蛋白定量，SDS-PAGE 电泳，半干法转膜，封闭，一抗孵育，洗膜，加入碱磷酶标记山羊抗兔IgG 标记的二抗孵育，BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒显色反应，拍照，保存图像。用Image-J 图像分析软件测条带的灰度值，并做统计学分析。

2.5 实时荧光定量PCR 检测海马NRSF mRNA 及miR-124 表达 参照Trizol 试剂使用说明的实验步骤提纯大鼠海马RNA，紫外分光光度计和电泳检测RNA 浓度、纯度和完整性。通过随机引物体外反转录获取cDNA，RT-qPCR 引物序列如下：NRSF 上游引物5'-AGGTTGGCTTAGTC-3'，下游引物：5'-TGGTCCTTGGGTGTCTCTTC-3'；miR-124 上游引物：5'-TTAAGGCACGCGGTGAATGCCA-3'，下游引物：5'-GCTGTCAACGATACGGCTACGCTAACG-3'；5Sr-RNA 上游引物5'-GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC，下游引物：5'-GCTGTCAACGATACGCTACGCTAACG-3'；β-actin 上游引物：5'-TCATCACCATTGGCAATGAG-3'；下游引物：5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3’。用SYBR'Green 染料法获得不同样本中目的基因的相对表达量。PCR 反应循环参数：95℃预变性15min；95℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸30s，共40 个循环。通过2-ΔΔCt算法，计算目的基因mRNA 相对表达量。

2.6 Nissl 染色 10μm 石蜡包埋切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精浸水，先用0.3%H2O2室温作用6～8min，接着浸入配制好的柠檬酸/柠檬酸钠中，95℃水浴15min。PBS 洗后用血清封闭，上一抗置于4℃48～72h。PBS 洗3 遍，以后的操作按VectABC 试剂盒进行，即生物素标记的二抗4℃过夜，PBS 洗3 遍，辣根过氧化物酶（HRP）标记的生物素卵白素复合物，37℃1h。然后梯度酒精脱水、二甲苯透明，中性树脂封片，光镜下观察。

2.7 统计学方法 应用SPSS 16.0 统计软件完成。符合正态分布的实验数据以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐时采用LSD 法，方差不齐采用Dunnett T3 法，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠定位巡航逃避潜伏期比较 随着训练天数的增加，各组大鼠逃避潜伏期都出现逐渐缩短，与对照组比较，模型组大鼠逃避潜伏期显著延长（P＜0.05）；与模型组比较，不同剂量的人参皂苷Rg1 组大鼠逃避潜伏期均有缩短，高剂量组在第3 天以后缩短显著（P＜0.05），其余各组差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组大鼠定位巡航逃避潜伏期比较（s，）

表1 各组大鼠定位巡航逃避潜伏期比较（s，）

注：对照组为健康大鼠，给予生理盐水；模型组大鼠给予10mg/kg 红藻氨酸建立癫痫模型；人参皂苷Rg1 低剂量组大鼠给予人参皂苷Rg1 10mg/kg 组；人参皂苷Rg1 中剂量组大鼠给予人参皂苷Rg1 30mg/kg；人参皂苷Rg1 高剂量组大鼠给予人参皂苷Rg1 60mg/kg；与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

3.2 各组大鼠空间探索实验结果和大鼠海马组织NRSF 蛋白表达量比较 探索实验结果显示，与对照组比较，模型组大鼠在目的象限（原平台象限）游泳时间百分比明显减少（P＜0.01）；与模型组比较，人参皂苷Rg1 高剂量组游泳时间百分比明显增加（P＜0.01）。与对照组比较，模型组大鼠海马组织NRSF 蛋白表达明显增多（P＜0.05）；不同剂量人参皂苷Rg1干预组较模型组均有减少，以高剂量组最显著（P＜0.05）。见表2，图1。

表2 各组大鼠目的象限游泳时间百分比和海马NRSF 与β-actin 灰度比值比较（）

表2 各组大鼠目的象限游泳时间百分比和海马NRSF 与β-actin 灰度比值比较（）

注：对照组为健康大鼠，给予生理盐水；模型大鼠给予10mg/kg 红藻氨酸（KA）建立癫痫模型；人参皂苷Rg1 低剂量组大鼠给予人参皂苷Rg1 10mg/kg 组；人参皂苷Rg1 中剂量组大鼠给予人参皂苷Rg1 30mg/kg；人参皂苷Rg1 高剂量组大鼠给予人参皂苷Rg1 60mg/kg；与对照组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

图1 各组大鼠海马NRSF 蛋白表达比较

3.3 各组大鼠海马组织miR-124、NRSFmRNA 表达量比较 与对照组比较，模型组大鼠海马组织miR-124 表达明显增多（P＜0.05）；人参皂苷Rg1 高剂量组较模型组明显增多（P＜0.05）。与对照组比较，模型组大鼠海马组织NRSF 表达明显增多（P＜0.05）；人参皂苷Rg1 高剂量组较模型组明显减少（P＜0.05）。见表3。

表3 大鼠海马组织miR-124 和NRSF mRNA 表达量比较（）

表3 大鼠海马组织miR-124 和NRSF mRNA 表达量比较（）

注：对照组为健康大鼠，给予生理盐水；模型大鼠给予10mg/kg 红藻氨酸（KA）建立癫痫模型；人参皂苷Rg1 低剂量组大鼠给予人参皂苷Rg1 10mg/kg 组；人参皂苷Rg1 中剂量组大鼠给予人参皂苷Rg1 30mg/kg；人参皂苷Rg1 高剂量组大鼠给予人参皂苷Rg1 60mg/kg；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

3.4 大鼠海马CA3 区组织Nissl 染色结果 Nissl 染色结果显示，对照组大鼠海马CA3 区锥体细胞排列整齐、紧密，细胞结构完整，神经元内布满深蓝色颗粒状的尼氏小体；模型组大鼠海马CA3 区锥体细胞排列疏松，部分神经元胞体皱缩、碎裂，核固缩，胞质内尼氏小体大量脱失；不同剂量人参皂苷Rg1 组大鼠海马CA3 区神经元皱缩、碎裂、尼氏小体减少、脱失较模型组减轻，以高剂量组减轻明显，见图2。

图2 大鼠海马组织CA3 区Nissl 染色结果（×400）

4 讨论

癫痫是儿童常见的神经系统疾病，且癫痫患儿更容易合并认知功能障碍[9]。研究发现，有多种药物能够改善成年人的认知记忆能力，包括脑循环改善药物、胆碱酯酶抑制剂等，但这些药物对于儿童癫痫患者来说缺少临床应用的证据[10-11]。本研究结果显示，人参皂苷Rg1 可以改善SD 大鼠幼鼠癫痫所致的认知功能障碍，而且可能与减少NRSF 的表达量及增加miR-124 的表达量有关，且高剂量组改善更明显。

NRSF 参与神经系统的发育，维持神经系统发育的平衡，与多种神经系统发育异常及相关疾病的发生密切相关[12]。癫痫发作后，海马内NRSF 表达上调，可以抑制神经细胞过度增殖、分化[3]。近年研究发现，NRSF 可通过调控miR-124 表达，在神经系统的协调发展中起到关键的作用，其相互作用为负反馈调控[12-13]。miR-124 已被证明参与脑神经发育与认知功能的调节，在癫痫发作时，多种神经元特异性miRNA与靶基因间相互调控，在神经和非神经系统中起重要作用，被认为可作为癫痫临床生物标志物[9，12]。有研究证实，在癫痫发作后海马内miR-124 表达上调，从而促进内源性神经干细胞的增殖与分化[14-15]。

Morris 水迷宫是研究学习记忆最常用的实验方法[16]。本研究通过KA 构建发育期慢性癫痫模型模型，利用Morris 水迷宫观察人参皂苷Rg1 对慢性癫痫模型大鼠的学习记忆功能的影响。检测各组实验大鼠海马内NRSF 蛋白和miR-124 的表达情况。我们发现，模型组大鼠逃避潜伏期较对照组延长，空间探索缩短，间接说明其伴有认知功能障碍；人参皂苷Rg1 高剂量组较模型组的逃避潜伏期明显缩短，空间探索延长，表明人参皂苷Rg1 可以改善癫痫所致的学习记忆损害，且呈剂量依赖性。模型组海马内NRSF、miR-124 较对照组明显增加，这也证实癫痫发作后NRSF、miR-124 表达量是增加的，人参皂苷Rg1 高剂量组海马内NRSF 表达量较癫痫模型组减少，而miR-124 的表达量增加，提示人参皂苷Rg1可以通过减少NRSF 的表达量及增加miR-124 表达量，改善癫痫所致的认知功能障碍。Nissl 染色结果也显示，人参皂苷Rg1 可以减轻发育期癫痫大鼠海马结构的病理改变。

综上所述，本研究结果显示，人参皂苷Rg1 可以改善发育期大鼠癫痫所致的认知功能障碍，这可能与减少NRSF 的表达量及增加miR-124 的表达量有关，且呈剂量依赖性。