系统性红斑狼疮患者尿液IFN-α 及TRP-KYN 通路与临床特征的相关性研究

余楷 何诗雅 陈丽莹 韩婷芬 杨科朋 王新昌

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是自身免疫介导的以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病，血清中多种自身抗体的产生和多系统受累是SLE 的两个主要特征[1]。临床上，尿液标志物的评估常常被忽略。犬尿氨酸（kynurenine，KYN）是吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenas，IDO）作用下的色氨酸（tryptophan，TRP）代谢产物。干扰素α（interferon α，IFN-α）等炎症因子可影响IDO 活性，造成TRP-KYN 通路失衡。研究表明，SLE 等自身性免疫疾病中伴有抑郁、焦虑和认知缺陷患者的KYN/TRP 比值存在异常[2]。SLE患者血清色氨酸浓度较正常人降低，KYN 水平和IDO 活性较正常人显著增高[3]。TRP-KYN 通路是免疫系统和神经系统之间相互影响的关键界面。IFN-α在SLE 的发病中起着至关重要的作用[4]，SLE 患者出现精神异常的分子机制很可能与IFN-α 等炎症因子诱导的TRP-KYN 通路异常有关。因此，为了寻求尿液中评价SLE 患者的生物标志物。本研究应用酶联免疫吸附测定（ELISA）分析SLE 患者尿液IFN-α 及TRP-KYN 通路与临床特征的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2020 年6 月至2021 年5 月就诊于浙江大学附属第二医院及浙江中医药大学附属第二医院风湿免疫科确诊为SLE 的患者75 例。本研究通过浙江大学附属第二医院及浙江中医药大学附属第二医院伦理委员会的批准[审批号：2020-KL-002-IH01，（2020）伦审研第（751）号]，所有患者在受试前已经签署相关知情同意书。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准：（1）符合2012 年SLICC 制订的SLE 分类标准[5]；（2）年龄14～65 岁；（3）患者知情并同意参加本研究。排除标准：（1）终末期肾病、Ⅳ级心力衰竭、肝衰竭、恶性肿瘤患者；（2）合并其他自身免疫病患者；（3）哺乳期女性。

1.3 方法

1.3.1 临床特征 记录患者的一般情况，包括性别、年龄、病程、治疗药物等。

1.3.2 尿液IFN-α、TRP、KYN 水平检测 采集患者尿液5mL，将尿液冻存于－80℃备用。采用南京草本源生物科技有限公司ELISA 试剂盒（人IFN-α ELISA 试剂盒，批号20 210503；人TRP ELISA 试剂盒，批号20210503-1；人KYN ELISA 试剂盒，批号20210503-02）进行尿液中IFN-α、TRP、KYN 水平检测。具体步骤：用无菌管收集尿液，离心20min（2000～3000r/min），仔细收集上清。分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释40μL，然后再加待测样品10μL（样品最终稀释度为5 倍）。将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃温育60min。将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释后备用。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5 次，拍干。每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。每孔加终止液50μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。以空白孔调零，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中尿液IFN-α 含量。尿液TRP、KYN 水平检测方法同上。

1.3.3 疾病活动度评分 系统性红斑狼疮疾病活动性评分[1]（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLE-DAI）对SLE 病情进行判断：0～4 分为基本无活动；5～9 分为轻度活动；10～14 分为中度活动；≥15 分为重度活动。以上计分为近10d 之内的症状和检查。

1.3.4 生存质量评估 通过官网（http://www.corptransinc.com），获取中文版狼疮生活质量量表（LupusQoL-China）及使用权。该量表包括34 条目，分为8 个维度，分别为：躯体健康、疼痛、计划性、性生活、对他人的负担、情绪健康、自我形体评价和疲劳。量表为Likert 5 级选择量表，1～5 级分别代表“一直如此”“大多数时间”“很多时间”“偶尔”“从不”，计分分别为0～4 分。

1.3.5 统计学方法 应用SPSS 20.0 软件统计处理和分析数据。对患者一般情况和疾病活动度进行统计描述。组间比较采用秩和检验；相关性分析采用Pearson 相关分析。以P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLE 患者临床特征 75 例SLE 患者女73 例，男2 例；年龄20～64（40.2±11.46）岁，＞60 岁的患者较少；病程＜5 年27 例，5～10 年24 例，＞10 年24 例；治疗方案多以激素+免疫抑制剂或激素+免疫抑制剂+中药治疗为主；大多数患者病情控制良好，基本无活动者41 例，轻度活动26 例，中度活动6 例，中度活动2 例；生存质量评分（109.8±15.4），＜100 分者有18例，100～109 分15 例，110～119 分19 例，≥120 分23例。见表1。

表1 系统性红斑狼疮患者临床特征（n=75）

2.2 SLE 尿液IFN-α 及TRP-KYN 通路与临床特征的相关性分析 SLE 患者尿液IFN-α 水平与病程、年龄、生存质量评分、KYN/TRP 比值、治疗药物无相关性，差异无统计学意义（P＞0.05）；SLE 患者尿液TRP、KYN、KYN/TRP 比值显示与病程、年龄、生存质量评分、治疗药物无相关性。但尿液IFN-α 水平与疾病活动度呈显著正相关（r=0.254，P＜0.05），见表2，图1。

表2 SLE 尿液IFN-α 及TRP-KYN 通路与临床特征相关性分析

图1 尿液IFN-α 水平与SLE-DAI 评分相关性（P＜0.05）注：SLE-DAI 为系统性红斑狼疮疾病活动性评分；IFN-α 为干扰素α

3 讨论

本研究结果显示，SLE 好发于40 岁左右的育龄期女性，病程可超过10 年。患者长期激素、免疫抑制剂和中药等维持治疗基本能控制病情于稳定。大多数SLE 患者生活质量下降。约91%SLE 患者会出现疲劳、头痛、情绪改变和认知障碍等非特异性的表现[6]。这些“轻微”神经精神症状对患者的生活质量有着显著的影响。然而这些表现相对隐匿，没有明显的脑部影像学改变，临床上常常忽视对这方面的关注。

TRP-KYN 通路与抑郁和精神分裂症等多种精神和心理健康疾病有着密切的关系，在神经系统中发挥着重要的作用[7-9]。IDO 主要存在于肝脏以外的组织细胞中，包括星形胶质细胞、小胶质细胞、单核-巨噬细胞、血管内皮细胞等，是肝脏以外催化TRP 沿KYN 通路代谢的唯一限速酶。IDO 受IFN-α的转录调控，也可受其他一些细胞因子的诱导增多，反之，又可通过CD19+DC 中B7 信号的反应参与IFN-α 水平的调控。这种双向反馈回路可能是预防过度炎症和自身免疫反应的一部分[10]。IDO 的增多促进TRP 朝着TRP-KYN 通路分解代谢，造成下游代谢的失衡，从而引发了如神经系统改变的临床表现（见图2）。

图2 IFN-α 诱导的TRP-KYN 通路失衡示意图

SLE 小鼠的代谢组学研究发现，SLE 存在TRP代谢失常[11]。Pertovaara等[12]研究发现，IDO 机制与SLE 发展进程相关，在相同条件下，SLE 患者与健康对照者相比，血清TRP 浓度降低、代谢产物KYN 增高，IDO 活性也明显增高。Akesson等[13]研究发现，SLE患者与对照组相比，TRP-KYN 通路中的下游代谢物喹啉酸和犬尿喹啉酸发生了改变。因此，TRP-KYN通路上的相关代谢指标极有可能成为反映SLE 患者“轻微”神经精神症状的生物标志物。但是本研究没有发现尿液中TRP、KYN 及其比值与疾病活动度、生存质量评分等临床特征的相关性，与IFN-α 也无相关性。造成SLE 患者精神改变和生活质量影响的因素是多方面的，可能无法单单用一条通路、几个指标去衡量，后续可进行多通路，多组学的探索。此外，尿液作为代谢产物的去路之一，能一定程度反映人体的某些代谢情况，但是亦有诸多不稳定的影响因素，包括代谢产物在尿液中的进一步反应降解等。对血浆、脑脊液的检测可能会更稳定、更准确地反映体内代谢水平的变化。

本研究发现，SLE 患者尿液IFN-α 水平与SLE疾病活动度呈显著正相关。既往研究表明，IFN-α 是SLE 发病的重要免疫细胞因子，在对抗病毒感染、抑制肿瘤生长、调控细胞分裂、参与免疫系统活化中起着重要的作用[4]。Niewold等[14]发现，SLE 患者及其健康亲属的IFN-α 活性高于正常人，具有明显的家族聚集性。对SLE 患者滑膜组织的直接分析显示，IFN诱导基因上调[15]。SLE 患者外周血淋巴细胞IFN-α基因的表达水平比健康志愿者外周血淋巴细胞高3倍。并随着临床症状改善而降低[16]。有报道，NZB/NZW F1 模型小鼠体内诱导产生IFN-α，在发生明显的病理学改变之前，这些小鼠在遗传上易患自发性狼疮样疾病，加速了狼疮自身抗体的产生和组织损伤[17]。IFN-α 在SLE 中有多种致病机制。异常增多的IFNα 通过调控免疫系统相关细胞的生存、活化及功能，促进SLE 的发生发展。SLE 目前临床诊断和治疗干预措施的选择主要依赖临床表现和血清学检查的复合评估。尿液生物标志物作为无侵入性评估工具以准确判断SLE 的疾病活动及预后很有吸引力。本研究结果显示，尿液IFN-α 作为SLE 患者临床疾病活动度生物标志物潜力，但仍需大样本的临床实验验证其可靠性。

综上所述，本研究未发现TRP-KYN 通路与SLE临床特征存在相关性，SLE 患者尿液IFN-α 水平与SLE-DAI 呈正相关，可能可以作为评估SLE 疾病活动的客观指标，值得进一步研究。