猴头菇多糖联合顺铂抗肺腺癌的作用研究

陈伟华 李超 林德辉 谭焕民

【摘要】目的：探讨猴头菇多糖（HEP）联合顺铂（DDP）抑制肺腺癌的作用。方法：采用 MTT 法檢测不同浓度 HEP 分别作用肺腺癌细胞株48 h、72 h 的细胞抑制率，不同浓度 DDP 作用肺腺癌细胞株48 h 的细胞抑制率，及 HEP 联合 DDP 作用肺腺癌细胞株48 h 的细胞抑制率。设对照组、HEP 组、DDP 组和联合组，观察 HEP 联合 DDP 对移植瘤的作用，采用 ELISA 法检测各组裸鼠血清中 IL-2水平。结果： HEP 对肺腺癌细胞具有一定的抑制作用，且具有时间和浓度依赖性。 DDP 能显著抑制肺腺癌细胞。HEP 可以促进 DDP 对于肺腺癌细胞和裸鼠移植瘤的抑制作用，可减轻 DDP 对裸鼠体重的影响。HEP 组和联合组小鼠血清中 IL-2水平显著高于 DDP 组。结论：猴头菇多糖可有效增强顺铂的抗肺腺癌作用，并减轻其不良反应。

【关键词】猴头菇多糖;肺腺癌;顺铂;IL-2

[中图分类号]R285.5[文献标识码]A[文章编号]2096-5249（2022）01-0012-04

Effect ofHericiumerinaceus polysaccharide combined with cisplatin on lung adenocarcinoma

CHEN Wei-hua*， LI Chao， LIN De-hui， TAN Huan-min （Department of oncology，Anhua County Peoples Hospital， Yiyang Hunan413500， China）

[Abstract] Objective： To study the effect of Hericiumerinaceus polysaccharide combined with cisplatin on lung adenocarcinoma. Methods： MTT assay was used to detect the cell inhibition rates of the lung adenocarcinoma cell lines treated with HEP for 48 h and 72 h， DDP for 48 h， and HEP combined with DDP for 48 h. The effect of HEP combined with DDP on transplanted tumor was observed in the control group， the HEP group， the DDP group and the combined group. The serum levels of IL-2 in four groups were detected by ELISA. Results： HEP could inhibit the lung adenocarcinoma cells in a time and concentration-dependent manner. DDP could significantly inhibit the lung adenocarcinoma cells. HEP could promote the inhibitory effect of DDP on the lung adenocarcinoma cells and the transplanted tumors of the nude mice. Moreover， it could reduce the weight loss of nude mice in the DDP group. The serum levels of IL-2 in the HEP group and the combined group were significantly higher than that in DDP group. Conclusion： Hericiumerinaceus polysaccharide might effectively enhance the anti-tumor effect of cisplatin on lung adenocarcinoma.

[Key words] Hericiumerinaceus polysaccharide; Lung adenocarcinoma; Cisplatin; IL-2

猴头菇，又名猴头菌，性甘、平，是一种药食兼用的真菌，其营养价值丰富。研究结果显示，猴头菇作用广泛，其具有良好的抗氧化活性，可增强细胞的抗疲劳和抗衰老能力[1]，能增强免疫力[2]。猴头菇多糖（Hericiumerinaceus polysaccharide， HEP）是猴头菇中一种重要的活性成分，可以开发成免疫佐剂 [3]，抗溃疡性结肠炎[4]。值得一提的是，猴头菇多糖还有一定的抑制肺癌等肿瘤的作用[5-6]。目前肺癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中均位列第一，其中最常见的类型为肺腺癌。根据2021版肺癌 NCCN 指南，针对不同基因突变，不断有新的靶向药物被批准应用于临床。但是对于没有基因突变的晚期肺腺癌患者，标准治疗仍然为以铂类为基础的联合化疗 [7]。因此本研究将从体外和体内层面探讨 HEP 与顺铂 DDP 在肺腺癌治疗中是否具有协同作用，为临床治疗提供新思路。

1 材料

HEP 委托湖南省中医药大学提纯制备，质量分数 75.22%，使用前用细胞培养液配置，DDP（Sigma- Aldrich 公司）;人肺上皮细胞 BEAS -2B、肺腺癌细胞株株 A549、H1299均购自中南大学高等研究中心;BEGM Kit 培养液（美国 Lonza 公司），RMPI- 1640细胞培养基和胎牛血清（FBS）（美国 Gibco 公司）;5周龄 BALB/c 雌性裸鼠（18±2）g，购自上海斯泰克实验动物有限责任公司。

2 方法

2.1细胞培养 BEAS -2B 用BEGMKit培養液， A549、H1299细胞用含有10% FBS 的 RMPI-1640培养基培养，置于5% CO2，37℃，饱和湿度细胞培养箱内。

2.2肿瘤细胞增殖实验肺腺癌细胞培养至对数生长期，用胰酶消化，细胞计数后用细胞培养液调整细胞浓度为1×105个 /mL。取96孔板，每孔接种100 μL细胞悬液，孵育24 h 后，更换培养液为100μL 含有不同浓度测试药物的新鲜培养液。每个浓度设置3个复孔，同时设置纯培养液为空白组，不加药物的细胞悬液为对照组。将96孔板置于 CO2培养箱孵育48 h 或72 h 后，每孔加入10 μL新鲜配置的噻唑蓝（MTT）溶液，孵育3～4 h。弃去培养液，每孔加入100μL 的 DMSO，用酶标仪检测492 nm 处的吸收值（A）。计算肿瘤细胞增殖的抑制率 I（%），抑制率=[1-（A药物-A空白）/（A 对照-A空白）]×100%。

2.3异种移植瘤裸鼠体内实验 A549细胞长至对数生长期，及时用胰酶消化，分别用 PBS 液洗涤 2次，不含血清的 RMPI-1640洗涤1次。再用不含血清的培基配成1×107个 /mL 的细胞悬液，每只注射100μL 于背部皮下。模型裸鼠随机分组，分别腹腔注等量空白溶剂（对照组，n=6），猴头菇多糖200 mL/kg（HEP 组，n=6），顺铂2 mg/kg（DDP 组，n=6）， HEP 200 mL/kg+DDP 2 mg/kg（联合组，n=6）。HEP 和DDP 均为隔日给药，连续给药21d，结束实验。

2.3.1检测抑瘤率分别在给药前、给药14 d、21 d 记录裸鼠体重。给药前、给药2周用游标卡尺测量瘤体的长径、短径，根据体积（mm3）=长径×短径2 /2计算肿瘤体积，根据抑瘤率=（对照组平均体积-药物组平均体积）/对照组平均体积×100%计算抑瘤率。

2.3.2白细胞介素（interleukin，IL）IL-2的检测给药21 d 后麻醉处死裸鼠，摘除眼球取血，提取血清。采用 ELISA 法检测各组裸鼠血清中 IL-2含量。

2.4统计学方法使用 SPSS 25.0进行统计分析，所得结果用x ±s 表示，多组间数据比较使用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1猴头菇多糖对肺腺癌细胞株的抑制作用MTT 法常用来检测不同物质抑制细胞活力的作用强度。我们选用常见的人肺上皮细胞 BEAS-2B、肺腺癌细胞 A549、H1299细胞株，采用 MTT 法检测0、4、8、16、32 μg/mL HEP 分别作用48 h、72 h 对细胞活力的影响。如图1所示，HEP 对人肺上皮细胞BEAS-2B 基本无影响，但是对肺腺癌细胞具有一定的抑制作用，且具有时间和浓度依赖性。两种肺腺癌细胞株的抑制率无明显差异，但是在不同时间点， A549细胞的抑制率均大于 H1299细胞。

3.2DDP 对肺腺癌细胞株的抑制作用如图2所示，分别用为0、2、4、8、16、32 μM的 DDP 处理不同肺腺癌细胞48 h 后，其细胞增殖受到抑制。且随着 DDP 浓度升高，A549细胞和 H1299细胞的抑制率均逐渐升高，呈现出明显的剂量依赖性。通过计算，DDP 对 A549细胞和 H1299细胞的 IC50分别为5.19μM 和5.66μM。

3.3 HEP 联合 DDP 对肺腺癌细胞株的抑制作用根据3.1、3.2的结果，HEP 和 DDP 对于 A549细胞株的抑制作用强于 H1299细胞株，因此我们选用 A549细胞株做后续实验。我们分别选用0、8、16μg/mL 的 HEP 分别联合0、4、8 μM的 DDP 作用肺腺癌，用 MTT 法检测48 h 对细胞的抑制率。如表2所示，猴头菇可以促进 DDP 对于肺腺癌细胞株的抑制作用，显著高于相应浓度单药组（P<0.05）。

3.4 HEP 与 DDP 联用对荷瘤裸鼠的作用根据预实验结果，我们选择 HEP 和 DDP 的实验浓度分别为100 mg/kg、1 mg/kg。与对照组相比，14 d 开始DDP 对裸鼠体重有影响（P<0.05），但是 HEP 单独应用与 DDP 联合应用对裸鼠体重无明显影响（P>0.05），详见表3。药物干预前对照组，DDP 组、HEP 组和联合组的裸鼠肿瘤体积无统计学差异（P>0.05）。治疗14 d 开始，与对照组相比，DDP 组、联合组移植瘤体积开始逐渐显著减小（P<0.05），第21 d HEP 组移植瘤体积显著减小，联合组与 DDP 组间差异显著，详见表4。

3.5不同组别裸鼠血清 IL-2含量变化与对照组比较，HEP 组和联合组小鼠血清中 IL -2水平比 DDP 组高，差异具有统计学意义（P<0.05），详见表5。

4 讨论

研究表明许多传统植物中包含有效成分，提取的多糖作用非常广泛：黄芪多糖有助于减少缺血再灌注人心脏微血管内皮细胞凋亡，减轻氧化损伤，抑制炎症介质分泌[8];红毛五加多糖可显著激活小鼠巨噬细胞[9];白毛藤多糖和地参多糖具有抗肿瘤作用[10-11]。既往研究发现从猴头菇中提取的多糖在肿瘤中具有一定的作用，可作为一种免疫佐剂促进肿瘤疫苗的作用[12]，对 Lewis 肺癌也有一定的抑制作用。我们的实验结果表明随着猴头菇多糖浓度的增加，其对于正常的支气管上皮无影响，但对肺腺癌的抑制作用逐渐加强。

顺铂等铂类药物抗癌谱广、作用性强。由于铂类药物为强蓄积性药物，在治疗恶性肿瘤有较大的毒性，容易产生肾毒性、消化道反应以及骨髓抑制等副作用[13]。我们发现：与单用猴头菇多糖、顺铂相比，猴头菇多糖可增强顺铂的抗肿瘤作用，且可以减轻顺铂对裸鼠体重的影响，说明猴头菇多糖可能在一定程度上还能减轻顺铂的不良反应。

IL-2是第一个被分子克隆的细胞因子，许多实验表明 IL-2是 T 细胞增殖、生成效应细胞和记忆细胞所必需的 T 细胞生长因子，能促进 Treg 细胞的生成、存活和功能活动，因此具有双重和相反的功能，维持 Treg 细胞以控制免疫应答和刺激常规 T 细胞以促进免疫应答[14]。IL -2还可以刺激 NK 细胞活化、分化和增殖，且与其他细胞因子协同作用，放大免疫效应。本实验结果显示猴头菇多糖可明显提高联合组裸鼠血清中 IL-2水平，提示猴头菇多糖可能通过提高 IL-2水平来促进顺铂的抗肿瘤作用，但是其具体机制还有待进一步探究。

猴头菇多糖由猴头菇中提取，后者是一类常见易获得的药食兼备的食物。我们的研究结果说明猴头菇多糖可协同顺铂明显抑制肺腺癌的生长，其远期应用前景值得期待。我们将通过细胞实验和已成功构建的裸鼠成瘤模型，深入探讨其具体作用通路和分子机制，为肺腺癌临床治疗提供新的有效方案。

参考文献

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基金项目：湖南省自然科学基金项目资助（编号：2018LL2002）

作者简介：陈伟华（1977-），女，湖南益阳人，学士，湖南省安化县人民医院肿瘤科。

通信作者：陈伟华，E-mail：2625809700@qq.com。

（收稿日期：2021-12-7 接受日期：2021-12-17）