片姜黄饮片标准汤剂质量标准研究

王晓亚，马智玲，陈敬然，张志强，沈建梅

(北京康仁堂药业有限公司 中药配方颗粒关键技术国家地方联合工程研究中心 北京市中药配方颗粒工程技术研究中心，北京 101301)

片姜黄为姜科植物温郁金CurcumawenyujinY.H.Chenet C.Ling的干燥根茎。味辛、苦，性温，具破血行气、通经止痛之功效[1]。临床上常用于治疗类风湿关节炎、骨关节炎导致的关节疼痛等[2]。片姜黄主要化学成分为倍半萜类、单萜类、姜黄素类化合物[3-5]。现代药理研究表明其具有抗氧化、抗炎镇痛、抗血栓凝血、抗肿瘤等作用[6]，其药理作用主要与其含有的倍半萜类化合物密切相关。

目前，对于片姜黄含量测定及特征图谱方面的质量控制研究较少，部分学者采用HPLC对片姜黄药材及饮片特征图谱方法进行了建构，多选用吉马酮为指标成分[7-8]，但吉马酮极性较小，水溶性较差，在标准汤剂中几乎不溶出，将其作为片姜黄配方颗粒质量指标有待商榷。莪术烯醇具有止痛[9]及抑制肝癌细胞、子宫内膜癌细胞生长的药理作用[10]，因此，本研究选用含量较高的药效成分莪术烯醇作为片姜黄标准汤剂的质量评价指标成分，结合特征图谱进行整体质量控制，判断更加准确、客观，符合临床用药需求，且为相关药物研发提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters ACQUITY UPLC©H-Class超高效液相色谱仪(沃特世科技有限公司)，Empower色谱工作站，ME104E电子天平(梅特勒·托利多)，BSA124S电子天平(赛多利斯)，JY2002电子天平(梅特勒·托利多)，KQ-500DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；电子恒温水浴锅DZKW-4(北京中兴伟业仪器有限公司)。

1.2 试药及试剂

片姜黄对照药材(批号：121006-201404)，中国食品药品检定研究院；莪术烯醇对照品(批号：E-003-181612)，成都瑞芬思生物科技有限公司；18批片姜黄饮片由北京康仁堂药业有限公司提供，经北京康仁堂药业有限公司质量检测中心鉴定为姜科植物温郁金CurcumawenyujinY.H.Chenet C.Ling的干燥根茎，经检验均符合药典规定，样品来源见表1。本试验根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求(征求意见稿)》制备18批片姜黄标准汤剂。乙腈、磷酸(Fisher Chemical)为色谱纯，甲醇、乙醇为分析纯，水为屈臣氏纯化水。

2 方法与结果

2.1 片姜黄标准汤剂制备

取片姜黄饮片，一煎加入饮片量8倍水，浸泡30 min，武火(500 W)煮沸后，文火保持微沸30 min，趁热过滤，迅速冷却，备用；二煎加饮片量6倍水，武火煮沸后，文火保持微沸20 min，趁热过滤，迅速冷却备用；合并滤液，50 ℃减压浓缩至料液比约为1∶1(相对密度为1.05～1.10(50 ℃))，冷冻干燥，即得。

表1 片姜黄饮片的来源信息

2.2 莪术烯醇含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters ACQUITYUPLC©BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱(0～8 min，5%→20%A；8～20 min，20%→33%A；20～28 min，33%→50%A；28～33 min，50%A；33～38 min，50%→80%A；38～40 min，80%→5%A)；检测波长：260 nm；柱温：40 ℃；流速：0.40 mL·min-1；进样体积：1 μL。色谱见图1。

图1 片姜黄标准汤剂与莪术烯醇对照品的对比图谱

2.2.2 对照品溶液制备 取莪术烯醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备 取片姜黄标准汤剂冻干粉适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)40 min，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 方法学考察 (1)线性关系考察。取莪术烯醇对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含莪术烯醇219.010 μg的对照品溶液，作为线性1；精密吸取对照品溶液5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，作为线性2；精密吸取线性2溶液5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，作为线性3；重复上述操作，依次作为线性4、线性5、线性6。精密吸取上述续滤液1 μL，注入超高效液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件测定莪术烯醇色谱峰峰面积，以莪术烯醇色谱峰的峰面积为纵坐标，莪术烯醇的浓度为横坐标，绘制标准曲线，求得莪术烯醇的回归方程为y=4 542.002 5x+1 445.537 3，R=1.000 0，其线性范围为6.844 μg·mL-1～219.010 μg·mL-1。

(2)重复性试验。取同一供试品(190617-611930-02)，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算得莪术烯醇的平均含量为1.521%，RSD为0.3%，表明该方法重复性良好。

(3)中间精密度试验。不同分析人员于不同时间采用不同仪器(Waters UPLC H-Class液相色谱仪(TUV检测器))进行中间精密度试验。取6份供试品溶液，测定莪术烯醇的含量。结果中间精密度试验所测得的莪术烯醇平均含量为1.510%，RSD值为0.7%，重复性试验检测结果的RSD为0.5%，符合中间精密度要求。

(4)稳定性试验。取同一供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样测定，记录莪术烯醇峰峰面积的变化情况，24 h内莪术烯醇的峰面积RSD值为0.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

(5)加样回收率试验。取莪术烯醇对照品适量，精密称定，加70%甲醇制成每1 mL含有61.81 μg的对照品溶液。取已知含量的供试品(190617-611930-02)6份，每份约0.1 g，精密称定，精密加入对照品溶液25 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定莪术烯醇的含量，并计算回收率。结果表明测得回收率范围为94.97%～96.28%，平均回收率为95.6%，RSD值为0.5%，表明该方法准确度良好。

2.2.5 样品含量测定 取18批片姜黄标准汤剂冻干粉，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定莪术烯醇含量。结果见表2。

表2 出膏率及莪术烯醇转移率测定结果 (%)

2.3 特征图谱的建立及分析

2.3.1 色谱条件 同“2.2.1”项下色谱条件，对片姜黄标准汤剂冻干粉供试品溶液进行3D全波长扫描，结果显示在240 nm处，图谱中色谱信息丰富，因此选用240 nm作为特征图谱检测波长。

2.3.2 参照物溶液制备 取片姜黄对照药材约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入70%甲醇25 mL，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)40 min，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，作为对照药材参照物溶液。另取“2.2.2”项下对照品溶液，作为对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备 同“2.2.3”项下供试品溶液制备方法。

2.3.4 方法学考察 (1)重复性试验。取6份供试品溶液，获得其特征图谱，以莪术烯醇峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD。结果表明，各特征峰的相对保留时间RSD在0.0%～0.1%范围内，相对峰面积的RSD在0.0%～2.4%范围内，表明该特征图谱方法重复性较好。

(2)中间精密度试验。采用Waters UPLC H-Class(TUV检测器)，取供试品溶液，获得其特征图谱，以莪术烯醇峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD。结果显示采用Waters UPLC H-Class(TUV检测器)获得的特征图谱中，各特征峰的相对保留时间一致，相对峰面积的RSD值在0.0%～0.9%范围内。不同仪器间各特征峰相对保留时间RSD值在0.0%～1.0%范围内，相对峰面积RSD值在0.0%～6.9%范围内，表明中间精密度良好。

(3)稳定性试验。取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h按上述确定的方法进样测定，获得其特征图谱，以莪术烯醇峰为参照峰，计算各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，并计算RSD。结果表明，各特征峰相对保留时间的RSD值在0.0%～0.1%范围内，相对峰面积的RSD值在0.0%～1.1%范围内，表明供试品溶液中特征成分在24 h内稳定性较好。

2.3.5 特征图谱的建立与相关性分析 分别制备18批片姜黄饮片标准汤剂的供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，将所得数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》软件[11]，采用多点校正将色谱峰自动匹配，中位数法计算得出样品特征图谱的共有模式，共确定4个共有峰，并与对照药材参照物色谱峰中的4个特征峰相对应，其中，峰3与莪术烯醇对照品参照物峰保留时间一致，见图2、图3、图4。以峰3(莪术烯醇)为S峰，计算各特征峰的相对保留时间。相对保留时间的规定值为0.28(峰1)、0.76(峰2)、1.25(峰4)。片姜黄标准汤剂4个特征峰在饮片中均能得到追踪，表明片姜黄标准汤剂与饮片化学成分基本一致，见图5。

3 讨论

参照《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》和《医疗机构中药煎药室管理规范》，片姜黄为根茎入药，当加入饮片量8倍的水量时，即可符合《医疗机构中药煎药室管理规范》中“煎煮开始时的用水量一般浸过药面2～5 cm”的要求，结合吸水率考察结果，确定片姜黄标准汤剂的煎煮工艺条件为：浸泡30 min，煎煮2次，一煎加入饮片量8倍水，煎煮30 min，二煎加入饮片量6倍水，煎煮20 min。

图2 18批片姜黄标准汤剂色谱

图3 片姜黄标准汤剂对照图谱及共有峰标识

图4 片姜黄标准汤剂与参照物对比图谱

图5 片姜黄饮片与片姜黄标准汤剂共有峰模式标准图谱对比

本试验对提取溶剂、提取浓度、提取方式及提取时间进行了供试品溶液制备考察。分别以水、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇作为提取溶剂，结果表明70%甲醇提取效果最佳；选择0.1 g·25 mL-1、0.2 g·25 mL-1、0.4 g·25 mL-1、0.8 g·25 mL-1进行提取浓度考察，结果显示浓度为0.2 g·25 mL-1可提取完全且峰面积适中；选择超声20、40、60 min及回流40 min进行提取方式及时间考察，结果表明不同提取条件下所得结果差异不大，为确保供试品均可提取完全，且考虑到操作的简便性，故选择超声处理40 min。

本试验基于UPLC采用同一梯度洗脱程序于不同检测波长条件下，建立了片姜黄标准汤剂的含量测定方法及特征图谱方法，方法学考察均符合要求，表明该方法稳定可行、测定结果准确可靠，特征图谱结合莪术烯醇定量的评价方法可较全面地反映片姜黄标准汤剂的内在质量，为片姜黄配方颗粒的质量控制及评价提供参考。

将片姜黄中提取的挥发油进样对比发现，片姜黄标准汤剂特征图谱中的4号峰为挥发油成分，由于其水溶性差，且提取、浓缩等过程中会造成挥发油损失，故转移率较低。因此，片姜黄配方颗粒需采用先提取收集挥发油，再将挥发油包合物与浓缩液混合后干燥的方式进行制备，以实现物质传递，使得片姜黄配方颗粒的主要成分能够与标准汤剂保持一致。