附子多糖研究进展

汝沈圆，高静东

(南京中医药大学附属苏州市中医医院，江苏 苏州 215000)

附子，又名乌头，拉丁文名AconitumcarmichaeliDebx.，是毛茛科乌头属植物的子根加工品，入药已有一千多年历史。《神农本草经》首次记录了附子，并在书中将其归为下品，是“大毒不可久服”的药物[1]。附子性味辛、甘、大热，有毒，归心、肾、脾经，主要功能有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛[2]。对于附子的研究目前主要集中在生物碱领域，但由于现代医学已经报道了植物多糖的许多生物活性，附子多糖的研究也逐渐增加。在过去的十几年里，人们发现附子多糖具有增强免疫、抗肿瘤、保护心肌细胞等作用[3]，对附子多糖的关注越来越多。本文就近年来附子多糖国内外研究进展进行综述。

1 附子多糖的结构和提取纯化

1.1 结构

多糖是指由糖苷键连接的10个或更多单糖形成的高分子聚合物，一般存在于动物、植物及微生物细胞壁中[4]。然而，由于分子量大且结构复杂，多糖的研究一直是个难点。ZHAO等[5]发现附子多糖的结构是α-(1/6)-d-葡聚糖，其平均分子量约为14 000 Da，且主链的每4个残基C-3上都有1个葡萄糖。而YANG等[6]通过一系列理化和仪器分析发现，纯化后的附子多糖由d-阿拉伯糖和d-葡萄糖组成，摩尔比为7.5∶92.5，平均分子量为6.29×106Da。这种结构和分子量的差异是由于不同的提取方法所致[7]。

S.MORENO-MENDIETA等[8]通过回顾性研究，阐明了植物或微生物来源的多糖生物活性与其结构相关，它们结构中的α/β-葡聚糖可以通过与特定受体结合来发挥辅助活性，但是不同来源甚至相同来源分离出的葡萄糖聚合物都可能有所不同，生物活性也受到一定影响。

1.2 提取

附子多糖的提取目前主要有热水浸提法、酶辅助法、微波提取法和超声法。钱珍[9]和吴娜等[10]皆采用热水浸提法，但吴娜在原有工艺的基础上利用反向传播人工神经网络(BP-ANN)进行分析和建模，得出最佳提取条件为时间3.5 h，温度90 ℃，料液比1∶20。朱盛林等[11]和张晓琳[12]分别在附子粉乙醇回流后采取微波辅助和植物复合酶辅助的方法提取多糖，张晓琳认为当温度为45 ℃、pH=4.5时，用浓度为1.4%的植物复合酶提取1.5 h的结果最佳，为15.77%。而朱盛林等测得当提取时间为10 min、温度为80 ℃、料液比1∶20时附子多糖的提取率更高，达16.10%。鲁静等[13]将附子粉末加入80%的乙醇中回流，料液比10 mL/g时利用超声在73 ℃的条件下提取34 min，最后得到的附子多糖平均提取率为19.05%(RSD=0.60%，n=3)，对比其他方法在提取时间和提取率上有一定优势。

1.3 纯化

附子多糖的提取目前已有较多报道，但纯化工艺却研究甚少，方法也大不相同。较为常见的是醇沉法，吴娜等[10]将浓缩后的附子多糖提取液放入80%乙醇中沉淀，过滤后直接干燥得到粗多糖。朱盛林等[11]在醇沉的基础上用无水乙醇、乙醚清洗沉淀，减少了有效成分在沉淀中的包裹损失。而丁兴杰等[14]在醇沉、离心后用Sevage液去除多糖溶液中的蛋白质，反复透析后得到精制多糖，纯度达91.89%。

2 附子多糖的药理作用

2.1 抗肿瘤

2.1.1 诱导癌细胞分化 彭文珍等[15]将人早幼粒白细胞HL-60分别放入加有全反式维甲酸、生理盐水和附子多糖的不同培养基中，结果发现附子多糖组的细胞核分化增多，部分早幼粒细胞分化为晚幼粒细胞，表明附子多糖对HL-60细胞有诱导分化的作用，且具有促进HL-60细胞朝粒细胞转化的可能，为临床应用附子治疗人早幼粒白细胞病提供了依据，但具体机制不清。

2.1.2 促进癌细胞凋亡 有研究显示，腹腔注射或灌胃给药的附子粗多糖和酸性多糖可以诱导肿瘤细胞的凋亡，从而延长H22和S180荷瘤小鼠的存活时间，发挥抗肿瘤作用[16]。SUN等[17]发现人脑胶质母细胞瘤U87MG细胞在附子多糖硫酸衍生物的作用下生长会受到抑制，并发生凋亡，其背后的原因可能与NF-κB/Bcl-2信号通路有关。而另有研究表明[18]，附子多糖培养48 h可以使H22细胞生存率显著降低，细胞凋亡明显增加。对比空白对照组，40 μg/mL的附子多糖大大减少了垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)的转录和蛋白质表达，有效降低Akt的磷酸化水平，增加磷酸化P38丝裂素活化蛋白激酶(P-P38 MARK)的蛋白水平。荷瘤小鼠模型展现出相似的数据。在该研究中，PTTG1的表达抑制被证实与附子多糖诱导的细胞凋亡密切相关，与P13/Akt和P38 MAPK信号通路也有一定关系，而既往研究表明许多肿瘤细胞的凋亡、增殖都与P13K/Akt、P38 MAPK通路有关联性[19-22]。因此我们可以推测，附子多糖可能通过抑制肿瘤转化基因1来增强P38 MAPK或减弱P13/Akt信号通路，从而达到促进细胞凋亡的效果。

2.1.3 抑制癌细胞的浸润转移 MMP-2、MMP-14、TGF-β1是肿瘤浸润转移的重要标志。安祯祥等[23]发现附子多糖作用后的胃癌移植瘤裸鼠瘤重显著降低，胃癌血清TGF-β1含量下降，MMP-2、MMP-14蛋白表达下调，其中200 mg/(kg·d)灌胃的裸鼠MMP-2、MMP-14mRNA表达明显下降，表明附子多糖可能通过下调MMP-2、MMP-14蛋白及其mRNA 的表达来抑制肿瘤的浸润转移，从而达到抑癌效果。ZHANG等[24]通过观察人乳腺癌MDA-MB-435s细胞经附子多糖及其硫酸衍生物作用后细胞迁移的程度，发现附子多糖(ACP1)及其硫酸衍生物(ACP1-s)可以显著抑制MDA-MB-435s细胞中肌动蛋白骨架的聚合，降低Vav2的磷酸化，削弱Rac1的激活，而后两者均为乳腺癌转移有前景的治疗靶点。其中，ACP1-s对MDA-MB435s细胞迁移的抑制作用强于ACP1，说明硫酸化可增强天然多糖对癌细胞迁移的抑制能力，对附子多糖及其硫酸衍生物在抗乳腺癌转移药物中的应用有指导意义。

2.2 促进免疫应答激活

2.2.1 诱导抗原递呈细胞分化和成熟 树突状细胞被认为是目前最强的抗原递呈细胞，且已被证实在抗肿瘤CD8+T细胞的初始交叉启动中起关键作用，在效应T细胞转运和过继T细胞治疗中也是必需的[25]。因此长期以来，人们一直希望通过增加树突状细胞作为促进T细胞效应功能的手段，但接种疫苗或使用树突状细胞生长因子等方法容易受到内源性免疫抑制细胞的影响[26]。在此基础上，有研究发现将外周血单个核细胞放入100 mg/L的附子多糖中培养，3 d后细胞出现分化，10 d后发展为典型的树突状细胞形态，CD80、CD83、CD86等共刺激分子表达均明显提高。与阳性对照组相比，附子多糖诱导的树突状结构细胞最大直径、表面积、树突数目均无明显差异，提示附子多糖可以促进树突状细胞的分化和成熟，从而活化T淋巴细胞、激发免疫应答[27]，为中药多糖作为免疫制剂参与抗肿瘤过程提供了可能性。

2.2.2 诱导淋巴细胞增殖 淋巴细胞增殖在免疫反应的激活级联中非常重要[28]。ZHAO等[29]分别在体外和体内测试了附子多糖作用下刀豆球蛋白(ConA)和脂多糖(LPS)诱导的脾淋巴细胞增殖情况，结果表明附子多糖可以剂量依赖性地促进由特异性有丝分裂原诱导的小鼠T细胞和B细胞的增殖，且当附子多糖剂量在一定范围内时，可以通过刺激脾脏中分泌抗体的B细胞来促进体内的体液免疫。GAO等[29]选取不同品种的乌头和药用部位，分别从中提取多糖，得到以淀粉、非淀粉型α- d葡聚糖和果胶多糖为主要成分的多糖组分。通过给药环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型，发现经多糖处理的小鼠淋巴细胞增殖显著增强，巨噬细胞被激活，与模型组相比，多糖组的细胞毒性明显提高。其中，果胶多糖比中性多糖展现出更显著的抗肿瘤和免疫刺激活性。

2.2.3 促进细胞因子释放 有研究表明，附子多糖连续灌胃能使H22荷瘤小鼠的胸腺指数、脾脏指数恢复正常，提升白细胞水平[30]。与此同时，给予附子多糖的荷瘤小鼠细胞因子水平(IL-2、TNF-α和IFN-γ)显著提升，且呈现剂量依赖性，提示附子多糖可能通过促进血清细胞因子的分泌来激活宿主机体的免疫反应，间接发挥抗肿瘤活性。

2.3 其他作用

2.3.1 抑制血管钙化 氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL)是导致血管钙化的主要原因之一，陈燕婷等[31]用该种方法制作了人体血管平滑肌细胞钙化模型，用不同浓度的附子多糖处理并观察细胞的变化。结果显示，附子多糖可以使碱性磷酸酶(ALP)的活性降低，骨相关蛋白Osterix、Msx2、BMP2的mRNA表达下调，收缩蛋白SMA的mRNA表达提高，对血管平滑肌细胞成骨样分化及细胞凋亡有抑制作用。其机制可能是通过降低神经酰胺水平和其代谢酶中性鞘磷脂酶(N-SMase)的活性，调节神经酰胺信号，从而达到抑制血管钙化的效果。

2.3.2 改善胰岛素抵抗 研究发现附子多糖可以增加3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗，对3H-葡萄糖在胰岛素抵抗脂肪细胞中的摄取也有促进作用,同时经过附子多糖培养后，胰岛素抵抗脂肪细胞跨膜转运蛋白GLUT4的转位量显著提高，但蛋白表达没有明显变化[32-34]。因此推测附子多糖可能是通过促进GLUT4转位，从而增加胰岛素抵抗脂肪细胞3H-葡萄糖的摄取，改善胰岛素抵抗，但具体机制尚不清楚。另有研究指出，在胰岛素抵抗的发展过程中，炎症是一个重要因素，而由肥胖诱导的组织炎症被认为是胰岛素敏感性降低的主要原因[35]。SU等[36]用附子多糖治疗高脂饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠，4周后小鼠空腹血糖显著降低，胰岛素敏感性增加，葡萄糖耐量得到改善，DIO小鼠脂肪组织和肝脏以及血清中炎症细胞因子的表达明显下降，肥胖小鼠全身炎症反应有所缓解。提示附子多糖可以作为治疗2型糖尿病靶向炎症的潜在药物，其机制可能与抑制核因子κB通路的激活，降低IRS-1的丝氨酸磷酸化和恢复PI3K/AKT途径对葡萄糖的利用等有关。

2.3.3 促进神经元再生和抗抑郁 附子多糖可以增加成年小鼠海马神经发生并产生抗抑郁效应。YAN等[37]实验研究表明，对雄性大鼠注射100 mg/kg的附子多糖连续14 d后，附子多糖不仅逆转了由长期社会失败压力引起的回避行为，使社交失败应激动物相互作用的时间增加，还逆转了海马神经发生的抑制，促进神经元的再生。另外，在注射BDNF-TrkB信号通路的trkB抑制剂后，附子多糖给药诱导的抗抑郁效应和细胞增殖被完全阻断，表明附子多糖的抗抑郁作用与神经源性效应和BDNF通路相关。

3 结语

附子的有效成分主要是二萜生物碱和附子多糖。二萜生物碱已被证实有抗炎、镇痛、抗肿瘤等功效[38]，但同时也可引发心脏和神经中毒等不良反应[39]。与之相比，附子多糖在具有众多生物活性的同时，几乎没有不良反应[40]，因此值得进一步研究。从上述报道可以看出，附子多糖抗肿瘤的途径主要分为两种，一种是对肿瘤细胞的直接作用，通过诱导分化、促进凋亡和抑制浸润转移等方式阻止癌细胞的发展；另一种是间接途径，通过刺激机体免疫力，增强宿主免疫反应来更好地发挥抗肿瘤效果。但在具体的案例中，附子多糖是通过哪一种途径抗肿瘤，或两种途径同时发挥作用尚不清楚，有待进一步探究。此外，有研究显示，多糖对肿瘤微环境的免疫治疗有积极作用，在增加NK、CTL细胞免疫毒性、激活巨噬细胞、促进细胞因子释放、降低免疫检查点表达等多个方面疗效显著[41]。附子多糖具有良好的刺激免疫应答作用，关于附子多糖与免疫治疗的关系是一个值得研究的方向。而由于多糖本身分子量大的结构特点，其生物利用度普遍较低。研究显示，某些多糖可以依靠不被吸收入体内，通过直接影响肠道菌群来抑制宿主肿瘤[42]。肠道微生物群与宿主具有共生关系，在宿主营养、免疫和代谢中起决定性作用，并可调节癌症治疗效果。这也可以解释为什么植物多糖不能很好地被吸收，但可以抑制肿瘤的生长。在今后附子多糖抗癌机制的研究中，对肠道微生物菌群的影响可以作为一个重要研究方向。另外，现在虽有许多报道证实了附子多糖的抗肿瘤作用，但对其抑瘤的有效剂量区间却鲜有讨论，对附子多糖起效的最大、最小剂量，最佳剂量区间仍不清楚。同时，从以上研究可以发现，附子多糖的纯化目前主要停留在粗多糖阶段，虽有一些除蛋白和层析方式的报道，但由于步骤繁琐、效率低下等原因，多数学者仍选择最简单方便的醇沉法。但随着对附子多糖功效的逐步探索，多糖制品的开发是必然趋势，届时纯化技术或面临新的挑战。

近几十年来，中草药多糖因其具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂和免疫调节等重要生物活性而备受关注[43]，附子多糖也不例外，但相比黄芪、当归、甘草等多糖成分，附子多糖的研究仍比较欠缺。为了进一步阐明附子多糖的药理作用及其作用机制，研究者们还需加强附子多糖的提取纯化、构效关系、作用途径、毒副作用等方面的研究，从而更加明确附子多糖对临床疾病的治疗意义，为附子多糖制剂的开发和临床应用提供更多依据。