GC-MS法同时测定复方牙痛宁搽剂中薄荷脑和冰片的含量

卢秋桃 ，胡燕梨，张金礼

(广州中医药大学第一附属医院，广东 广州510400)

复方牙痛宁搽剂是由松花粉、丁香、薄荷脑、花椒、冰片和茵陈等药味加辅料麻油制成的搽剂，具有消肿、消炎和止痛的功效。方中冰片和薄荷脑均有清热抗炎、消肿止痛的作用[2-6]，两者均为方中君药，且与该药效一致。原标准收载于国家中成药标准汇编口腔肿瘤儿科分册[1]中，仅有薄荷脑的鉴别项目，无含量测定控制项目。冰片是由龙脑和其在合成过程中产生的异龙脑两种同分异构体组成的，目前对于冰片和薄荷脑的测定主要采用气相色谱法[7-10]。由于复方牙痛宁搽剂处方中含挥发性成分较多，基质干扰较大，而气相色谱串联质谱(GS-MS)联用仪是一种灵敏度高、选择性好的仪器，测定中成药中挥发性成分具有较大优势，因此本实验参考相关文献[11-15]报道建立GS-MS法同时测定复方牙痛宁搽剂中薄荷脑和冰片的含量，为其质量控制提供参考，同时也为进一步提高复发牙痛宁搽剂的质量标准提供实验依据。

1 仪器与试药

ShimadzuTQ8040气相色谱三重四级杆质谱联用仪(日本岛津仪器公司)；GC-MS实时分析，GC-MS再解析工作站；气质专用色谱柱SH-Rxi-5Sil MS(0.25 mm×30 m，0.25 μm)(日本岛津仪器公司)；XP204E型电子天平(瑞士梅特勒)；KG-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。复方牙痛宁搽剂(西安必康嘉隆制药有限公司，批号181101、190601、191201，每瓶5 mL)。对照品：龙脑(批号：110881-201709，质量分数以99.6%计)、异龙脑(批号：111512-201603，质量分数以96.7%计)、薄荷脑(批号：110718-201707，质量分数以99.8%计)，储存温度2～10 ℃，对照品均购于中国食品药品检定研究院，供含量测定使用；正己烷为色谱级(美国Fisher公司)；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：SH-Rxi-5Sil MS(30 m ×0.25 mm，0.25 μm)，分流进样；分流比20∶1，进样口温度300 ℃，柱箱初始温度70 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升温至300 ℃，保持5 min。载气：高纯氦气，柱流量1 mL·min-1，进样量1 μL。

2.1.2 质谱条件 离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃，溶剂延迟时间2 min，电离方式：EI，电子能量70 eV，扫描方式Q3Scan，质量扫描范围：45～500 amu，检测器电压0.2 kV，采用Q3全扫描方式获得对照混合溶液的TIC图，从而确定各成分的保留时间和特征离子，然后采用SIM扫描方式进行定量，龙脑、异龙脑和薄荷脑的定量离子分别为m/z95、71。在上述色谱和质谱的条件下，混合对照品、供试品及阴性样品的总离子流见图1，利用供试品溶液的TIC图，分别对各峰进行质谱扫描，并采用仪器提供的NIST标准质谱库进行检索，并与文献报道[11，15]进行比较。异龙脑、龙脑和薄荷脑的质谱见图2。

注：1.薄荷脑；2.异龙脑；3.龙脑。

图2 异龙脑、龙脑和薄荷脑的特征离子碎片

2.2 对照品溶液的制备

精密称取龙脑对照品10.26 mg，异龙脑对照品12.18 mg，薄荷脑对照品8.06 mg置同一10 mL量瓶中，加正己烷溶解稀释至刻度，作为5号混合对照品溶液(每1 mL含龙脑1.021 9 mg，异龙脑1.177 8 mg，薄荷脑0.804 4 mg)。

2.3 供试品溶液制备

取本品10瓶，混匀，精密吸取2 mL置锥形瓶中，精密加入正己烷25 mL，密塞，称定质量，超声10 min，放冷，再称定质量，用正己烷补足减失的质量，摇匀，用Ø0.22 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性样品制备

按照复方牙痛宁搽剂的处方工艺和处方量的1/10，分别取缺冰片和薄荷脑的的样品作为模拟冰片阴性样品，模拟薄荷脑阴性样品。

2.5 专属性实验

分别取上述对照品、供试品和缺冰片的阴性样品及缺薄荷脑的阴性样品，按照“2.1”下方法进行测定，记录总离子流图，结果发现阴性样品对冰片和薄荷脑的测定无干扰。

2.6 线性关系考察

分别精密吸取 “2.2”项下的5号混合对照品溶液100 μL、500 μL、1 mL、2 mL分别置10 mL量瓶中，依次作为1-4号对照品混合溶液，按照“2.1”项下色谱质谱条件进行测定，分别以定量离子的峰面积为纵坐标(Y)，以进样量的质量(ng)为横坐标(X)，进行线性回归，测定结果见表1、表2、表3、表4。

表1 龙脑标准曲线测定结果

表2 异龙脑标准曲线测定结果

表3 薄荷脑标准曲线测定结果

表4 龙脑、异龙脑及冰片的线性方程相关系数及线性范围

2.7 精密度试验

取“2.3”项下供试品溶液，连续进样6针，进行测定，结果表明，供试品溶液中定量离子龙脑峰面积的RSD为0.71%，异龙脑峰面积的RSD为0.74%，薄荷脑峰面积的RSD为1.05%，且都小于3%，说明该方法精密度良好。

2.8 稳定性试验

取“2.3”项下供试品溶液，分别在0，1，2，4，8，12，16，20，24 h进行测定，记录各色谱峰面积，结果龙脑、异龙脑和薄荷脑峰面积的RSD分别为2.81%、2.24%和1.96%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验

取同一批号181101的牙痛宁搽剂样品6份，然后分别按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱质谱条件进行测定，结果龙脑、异龙脑及薄荷脑的含量分别为10.02、18.54和7.85 mg/mL，RSD值分别为1.21%、2.06%、0.98%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

精密量取已知含量同一批号181101的牙痛宁搽剂样品1 mL，共制备6份，然后分别精密称取龙脑约10 mg、异龙脑18 mg和薄荷脑7.8 mg，各6份，分别加入上述6份供试品溶液中，然后按照“2.3”项下供试品溶液制备方法制备，按照“2.1”项下色谱质谱条件的方法进行测定，分别计算龙脑、异龙脑和薄荷脑的平均回收率。结果见表5。

表5 回收率试验结果 (n=6)

2.11 样品含量测定

取不同批号的3批复方牙痛宁搽剂，按照“2.3”项下供试品溶液制备方法，每批样品平行制备2份，按照“2.1”项下色谱质谱条件进行测定，以外标法分别计算3批样品中龙脑、异龙脑和薄荷脑的含量，测得结果见表6。

表6 复方牙痛宁搽剂样品含量测定结果 (n=2，mg/mL)

3 讨论

3.1 指标成分选择

冰片主要分为天然冰片和合成冰片，天然冰片具有清热止痛、治疗咽喉肿痛的作用；合成冰片主要是采用樟脑、松节油、α-蒎烯等原料进行合成，在合成过程中会产生或残留一些樟脑等杂质。樟脑内服时会对人体产生一定的毒副作用[16]，薄荷脑是唇形科植物薄荷全草提炼出来的结晶，具有特殊清凉的薄荷香气，内服可以治疗牙痛、咽喉等炎症，具有清凉止痒的作用。冰片与薄荷脑二者于本品的药理作用一致。GC-MS仪具有分析速度快、灵敏度高、选择性高的优点，可以用于挥发性成分的分析，因此本实验选择冰片和薄荷脑作为复方牙痛宁搽剂中主要测定指标成分。

3.2 供试品制备及色谱条件选择

本实验分别考察了无水乙醇、正己烷、乙酸乙酯和甲醇分别作为供试品的提取溶剂，结果发现正己烷提取效率高于其他溶剂，且总离子流图峰形较好，因此选择正己烷作为提取溶剂。接着考察了气相色谱条件，由于样品是中成药，基质复杂，因此选择程序升温方式进行考察，同时尽可能使样品在较短时间内出峰，因此当采用上述色谱条件时，分离效果较好，同时对离子源温度200 ℃、230 ℃，接口温度230 ℃、250 ℃进行考察，结果发现其影响不大，因此为了保护离子源和接口，故选择较低温度作为实验所需温度。

3.3 系统耐用性

实验分别采用Agilent HP-5 MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、Agilent PEG-20M MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)和岛津SH-Rxi-5Sil MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)3个色谱柱进行测定，并考察了不同载气流速、不同进样口温度、不同分流比、不同检测器温度等因素，结果发现当上述条件在微小范围内变动时，均不影响冰片和薄荷脑的含量测定，因此本文方法系统耐用性符合要求。

4 结语

本实验通过建立GC-MS法同时测定复方牙痛宁搽剂中龙脑、异龙脑和薄荷脑的含量，具有分析速度快、选择性好、灵敏度高的优点，比目前采用气相色谱分析具有节省时间、灵敏度高的优点，该方法经过方法学验证可以用于复方牙痛宁搽剂的质量控制，比目前标准中单一测定冰片的含量更加全面，可为改进和提高复方牙痛宁搽剂的质量标准提供参考。