桃红四物汤对肺纤维化大鼠血清炎症因子的影响

周 勇，范伏元，柳玉佳，李 妲

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208 2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007)

肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)是以肺泡间质炎症细胞浸润、纤维母细胞增生和肺泡间质纤维结缔组织沉积为特征的免疫介导的慢性进展性疾病[1]。该病预后不佳，生存率低，中位生存期为2～3年，我国肺纤维化的5年生存率大约为30%，严重威胁人类健康[2]。目前，肺纤维化的发病机制尚不完全清楚，但炎症反应与之联系紧密[3]。西医治疗肺纤维化的手段有限，长期应用糖皮质激素和免疫抑制剂的副作用较大。因此，寻找治疗PF的新思路意义重大。桃红四物汤是中医经典名方，源自《医宗金鉴》，具有养血、活血祛瘀之效，广泛应用于冠心病、脑梗死、糖尿病、关节炎等疾病的治疗[4]。临床研究表明，桃红四物汤可以抑制血清中的炎症因子，从而达到治疗相关疾病的效果[5-6]。本次研究提出假设，桃红四物汤可能通过降低模型大鼠炎症因子表达，从而起到治疗肺纤维化的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级SD雌性大鼠50只，体质量(200±20)g，由湖南中医药大学实验动物中心统一代购，动物供应商编码：GYS-201905230001，质量合格编号：ZS-202011170012，伦理审核编号：LLBH-202010150003，饲养于湖南中医药大学实验动物中心SPF清洁级动物实验室。

1.1.2 实验药物 甲泼尼龙片剂(天津天药药物股份有限公司，国药准字：H20020224)，桃红四物汤组成：当归、熟地、川芎、白芍、桃仁各10 g，红花6 g。各药物均选用湖南中医药大学第一附属医院中药房药材。先取各药加水适量，花、叶、细茎类质地较疏松和轻浮的植物药一般浸泡20～30 min后入煎，根、果实类药物需浸泡60 min后入煎。第一遍煎煮时水量应为药材量的5～8倍。煎药一般先用大火煮沸后，再用文火煮，本次实验煎2次。第1次煎制结束后，将药汁滤出，重新加水至高出药平面约0.5～1 cm，进行第2次煎制。

1.1.3 实验材料 博来霉素(北京索莱宝科技有限公司，货号：Z8020)，多聚甲醛(Biosharp生物公司，货号：2275)，水合氯醛(天津市科密欧化学试剂有限公司)；台式高速离心机(塞维尔servicebio生物科技有限公司D1008E)，大鼠IL-1β、IL-6、TNF-αELISA检测试剂盒(美国AndyGene公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备 采用气管内滴注博来霉素制备PF模型，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉大鼠，后将其固定，使大鼠的头部与桌面呈约30°夹角，剃颈毛，消毒颈部皮肤，严格无菌操作下，用外科手术刀在颈中作长约1 cm切口，充分分离并暴露气管，直视下将装有博来霉素(4 mg/kg)的1 mL注射器针头穿刺两环状软骨间的气道中，快速将药物推入气管中，期间保持针头稳定在气管中央，退针后将鼠板与桌面呈90°夹角，来回旋转鼠板，尽可能使博来霉素均匀分布在双肺中。再用手术线缝合伤口，待大鼠麻醉醒后置于鼠盒，放回笼位饲养。对照组采用上述方法给予等体积生理盐水[7]。

1.2.2 动物分组及给药方式 50只大鼠适应性喂养1 d后随机分成5组，每组10只：Ⅰ空白组、Ⅱ模型组、Ⅲ甲泼尼龙组、Ⅳ桃红四物汤低剂量组、Ⅴ桃红四物汤高剂量组。灌胃给药，从造模24 h后起，每天1次，连续灌胃28 d，直到取材。参照人体与动物体表面积的折算系数[8]，将给药量按标准体重换算成大鼠的每日用药剂量，将甲泼尼龙片剂制备成0.2 g/L的混悬液，中药汤剂熬制成低剂量为2 g/mL，高剂量为4 g/mL的水煎剂；Ⅲ组给药剂量为1.8 mg /( kg·d)，Ⅳ组给药剂量为2 g /( kg·d)，Ⅴ组给药剂量为4 g /( kg·d)。空白组、模型组给予等体积0.9%氯化钠注射液。

1.3 观察指标及检验方法

连续给药28 d后，用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，室温静置30 min后离心(4 500 r·min-1，5 min，4 ℃)，分离血清，严格按照ELISA试剂盒说明书方法检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。取大鼠左侧肺组织以4%多聚甲醛固定，采用苏木素-伊红(HE)染色，在光镜下观察肺组织肺泡炎症和纤维化程度。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 病理组织观察

大鼠肺组织的HE染色结果如图1显示，空白组大鼠肺组织结构正常，肺泡腔明显，肺泡壁薄，肺组织未见明显充血水肿，未见炎症细胞浸润。模型组大鼠肺泡腔缩小，肺泡壁明显增厚增宽，可见大量炎症细胞浸润，部分细支气管上皮细胞脱落。甲泼尼龙组及桃红四物汤低、高剂量组肺组织与模型组相比较，肺泡壁变薄，可见局部充血，少量炎症细胞浸润，其中甲泼尼龙组和高剂量桃红四物汤组的纤维化程度更低。见图1。

图1 各组肺组织HE染色观察(×200倍)

2.2 各组血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比较

与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高(P<0.05)。与模型组比较，甲泼尼龙组、桃红四物汤低、高剂量组血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α显著降低(P<0.05)。其中，甲泼尼龙组与桃红四物汤高剂量比较IL-1β、IL-6、TNF-α差异不具有显著性(P>0.05)，甲泼尼龙组与桃红四物汤低剂量比较IL-1β、IL-6、TNF-α差异具有显著性(P<0.05)，桃红四物汤剂低剂量组与桃红四物汤高剂量组之间IL-1β、IL-6、TNF-α差异不具有显著差异性(P>0.05)。见表1。

表1 5组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量

3 讨论

肺纤维化属于中医学“肺痹”和“肺痿”等范畴，《素问·痹论篇》记载：“肺痹者，烦满而喘”，《素问·五脏生成》提出：“有积气在胸中，喘而虚，名曰肺痹。”《金匮要略》将肺痿单独列为专篇论述，指出：“痿者萎也，如草木之萎而不荣。”其病因病机复杂，中医认为气虚、痰阻、瘀血是主要病理因素，早期肺脾气虚为主，外邪侵袭肺及脉络，致痰瘀互结，病程延绵，在治法上主张清热化痰治标的同时，也注重活血化瘀以治本[9]。有医家认为，血瘀贯穿于肺纤维化的全过程，活血化瘀法贯穿于肺纤维化治疗之始终[10]。桃红四物汤是在四物汤的基础上加入活血化瘀的桃仁、红花，使其在调补气血的同时，活血化瘀的功效更佳。

肺纤维化的病理特征为早期肺泡上皮细胞的弥漫性损伤，引起肺泡炎症，当肺部炎症持续存在，而免疫相关因子通过转导途径扩大肺组织的损伤，导致大量成纤维细胞聚集，驱动胶原、ECM沉积和组织收缩，引起肺实质增厚及瘢痕形成[11]。TNF-α是一种重要的炎症介质，有聚集炎症细胞的作用，肺损伤早期增加的TNF-α可上调黏附分子和化学趋化分子，是损伤肺炎症细胞浸润的原因，TNF-α也是一种致纤维化因子，可刺激成纤维细胞的增值；IL-1β、IL-6 是重要的促炎因子，主要功能是通过趋化炎症细胞聚集和促进炎细胞浸润，加速肺纤维化早期的肺泡炎症反应，进而介导特发性肺纤维化的发生[12]。现代研究证实，桃红四物汤可通过提高抗氧化能力，降低过氧反应等对CCl4诱导的肝纤维化起到保护作用[13]，且具有抑制TNF-α和IL-6的失控性释放，清除炎症介质，减少炎症渗出，促进炎症吸收的作用[14]。本研究结果显示，通过博来霉素制作的肺纤维化大鼠模型组与空白组比较，肺泡壁增宽增厚，肺组织结构紊乱，炎性细胞渗出明显，表示造模成功，而TNF-α、IL-1β、IL-6明显升高，表示炎性因子在肺纤维化中发挥重要作用。与模型组比较，药物干预组肺组织少量炎性细胞浸润，肺泡壁较薄，TNF-α、IL-1β、IL-6降低，且随着剂量上升，指标下降更明显。与甲泼尼龙组比较，桃红四物汤低剂量组肺组织损伤更严重，炎症因子升高；桃红四物汤高剂量组肺组织及炎性因子无明显变化。这说明桃红四物汤能明显降低肺纤维化中的炎性因子，改善肺纤维化组织结构，其中高剂量组效果与甲泼尼龙相似，病理结果也证实了此结论。

综上，桃红四物汤可以抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的释放，通过抗炎作用发挥抗纤维化作用，其抗纤维化机制有待进一步明确。