星点设计-效应面法优化野黄芩苷镁温敏型鼻用原位凝胶的制备

王雨欣，常金花，杨 菲，刘翠哲

(承德医学院 河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000)

野黄芩苷又名灯盏花乙素，是从干燥全草灯盏细辛中分离得到的灯盏花素的主要成分，属于黄酮类活性成分，其临床主要用于心脑血管疾病的治疗[1]。石森林等[2-3]将灯盏花素制成温敏型原位凝胶，对脑缺血等心脑血管疾病有明显的改善作用，且效果优于静脉注射。

研究表明黄酮类化合物与金属离子反应成盐后，不仅能提高溶解度，还可以增强生物活性[4]。镁离子是人体必须的常量元素，具有保肝、抗缺血再灌注损伤等广泛的药理作用，且心脑血管疾病的发病因素与镁也有关[5-6]。因此本课题组在前期研究中，以野黄芩苷和氢氧化镁为原料，化学合成法制备了野黄芩苷镁盐，其溶解度显著高于野黄芩苷，而且其对抗脑缺血再灌注损伤的药效明显优于野黄芩苷[7]。鼻腔给药系统[8-9]是药物达到脑部靶向作用的途径之一，药物分子与鼻黏膜长时间接触，从而被吸收，并绕过血-脑屏障进入脑部，起到治疗作用，且效果优于注射等其他给药途径。温度敏感型原位凝胶[10-11]低温时呈液态，温度升高便形成凝胶状态，可黏附于鼻黏膜表面，从而延长药物在鼻腔中的作用时间，提高生物利用度，并能有效解决鼻纤毛对药物的清除作用，提高药效。因此，本课题将野黄芩苷镁制成鼻用温敏型原位凝胶，采用星点设计-效应面法优化其处方。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LGJ-22D冷冻干燥机(北京四环科学仪器厂有限公司)；ZNCL-GS智能数显磁力(加热锅)搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)；Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；METTLERTOLEDO实验室pH计(瑞士梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；JA2003型电子天平(上海精科天平仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

野黄芩苷镁(自制，批号：20201224，纯度：96.86%)；野黄芩苷对照品(源叶生物，批号：B21478，纯度：HPLC≥98%)；泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)(北京凤礼精求医药股份有限公司)；NaOH(天津欧博凯化工有限公司)；磷酸氢二钾(天津市福晨化学试剂厂)；氢氧化镁(天津市光复精细化工研究所)；乙腈、甲醇、磷酸(色谱纯，美国MREDA公司)；纯净水(天津娃哈哈食品有限公司)。

2 方法与结果

2.1 温度敏感型原位凝胶的制备

采用冷溶法[12]制备黄芩苷镁温敏型原位凝胶。首先，分别精密称取处方量的P407和P188，置于50 mL烧杯中，加入纯水10 mL，搅拌溶解。在4 ℃环境下存放24 h以上，充分溶胀，得到澄清、无气泡、无团块的空白凝胶基质；再取处方量的野黄芩苷镁，精密称定，置于空白凝胶基质中，在常温下搅拌混匀，直至野黄芩苷镁全部溶解，放入4 ℃冰箱24 h得到野黄芩苷镁温敏型原位凝胶。

2.2 相变温度(T)的测定

采用搅拌子法[13]测定。据文献报道，温度在25～27 ℃之间，温敏凝胶易在体外发生相变[14]，但夏季温度高，其在室温便会成凝胶状态，需低温保存，依据鼻腔的生理温度(29～34 ℃)[15]，来选择各辅料的用量。

2.3 P407和P188对T的影响

采用单因素试验设计，制备含有不同质量分数的P407和P188的凝胶来考察两者之间的关系。从结果分析，随着P407的质量分数升高，T降低，如图1，P407浓度≤15%时，在测试温度范围内不形成凝胶，当浓度>25%时，温度过低，易在室温下就形成凝胶，但当P407浓度为23%和25%时，不仅T低，且P407用量也多，所以将P407的浓度范围定为17%～21%；而当P188质量分数增加，T升高，并且当P407浓度小于21%时，加入1%的P188，T也会过高，因此将P188的浓度定为0%～1%，见图2。

图1 溶液的相变温度随着P407浓度变化曲线

图2 P188对不同浓度P407相变温度的影响

2.4 处方优化

2.4.1 试验设计 在单因素试验基础上，选取P407的范围为17%～21%，P188的范围为0%～1%。根据星点设计-效应面法原理，每个因素五水平，分别为：±1.414，±1，0。两因素水平及结果见表1和表2。

表1 效应面设计因素与水平

表2 实验设计及响应值

2.4.2 模型拟合

采用Design-Expert10软件对两因素与T进行回归分析，得到二项式方程为Y=30-4.74A+0.94B-0.5000AB+2A2-0.25B2(R2=0.9779，P<0.000 1)，P<0.000 1，表明两因素与T之间具有显著的相关性；R2(相关系数)为0.977 9，说明该模型具有一定的可靠性；AdjR-Squared(校正拟合度)为0.962 2和PredR-Squared(预测拟合度)为0.843 1，两者的差值<0.2，说明该二元多项式方程的拟合度和可信度较高。综上所述，该模型的预测性可靠，结果见表3。

表3 二项式方程拟合模型方差分析结果

2.4.3 效应面优化与预测 用Design-Expert10软件生成两因素对T的二维等高线图和三维效应面图，见图3。试验结果与单因素试验结果一致。得处方：P407 19%、P188 0.5%。

图3 各因素对相变温度影响的二维等高线及三维效应面

2.4.4 工艺验证 按预测的最优处方制备野黄芩苷镁鼻用温敏型原位凝胶3份，测T，见表4。预测值与实际值接近，表明该优化过程可靠。

表4 优化处方及结果 (℃)

2.5 野黄芩苷镁温敏型原位凝胶的外观检查和pH值

按照“2.4.4”项下方法制备3批野黄芩苷镁温敏型原位凝胶，进行pH值的测定，并且用肉眼观察其性状，结果见表5。依据2020版《中华人民共和国药典》四部的制剂通则，本研究制备的野黄芩苷镁温敏型原位凝胶的外观和pH值均符合鼻用制剂的相关规定。

表5 野黄芩苷镁原位凝胶pH及外观的测定结果

2.6 含量测定方法的建立

2.6.1 色谱条件[16]Agilent C18色谱柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流动相为乙腈-0.1%磷酸水(22∶78，V∶V)，检测波长为335 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，进样量10 μL。

2.6.2 溶液制备 对照品溶液：精密称取10.02 mg野黄芩苷对照品，加甲醇超声定容，制成196.392 μg/mL的对照品溶液。供试品溶液：精密称取1 mL野黄芩苷镁鼻用温敏型原位凝胶于100 mL容量瓶中，加纯水超声定容，摇匀，即得。阴性对照溶液：精密称取空白凝胶适量，同供试品溶液制备，得阴性对照溶液。

2.6.3 专属性考察 按照色谱条件，取“2.6.2”项下溶液各10 μL进样，对照品中野黄芩苷和供试品中野黄芩苷镁与其他组分可基线分离，阴性对照品在野黄芩苷镁位置处无干扰，结果见图4。

图4 专属性考察结果

2.6.4 线性关系考察 取“2.6.2”项下的对照品溶液用甲醇成倍稀释，得6.137、12.275、24.54、49.098、98.196、196.392 μg/mL的标准溶液，HPLC测定，得标准曲Y=30.72X-246.83，R2=0.999 0，表明野黄芩苷在6.137～196.392 μg/mL范围内的线性关系良好。

2.6.5 精密度试验 吸取“2.6.2”项下的对照品溶液10 μL，连续进样6次，计算RSD值为0.56%，表明仪器精密度良好。

2.6.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于室温下保存，分别于0，2，4，6，8，10，12 h进样测定，计算RSD值为1.06%，表明该样品在12 h内稳定性良好。

2.6.7 重复性试验 精密称取野黄芩苷镁鼻用温敏型原位凝胶共6份，制成供试品溶液，按色谱条件测定，RSD为0.68%。

2.6.8 加样回收率试验 取野黄芩苷镁原位凝胶0.5 mL(相当于野黄芩苷镁2.45 mg)，分别加入野黄芩苷对照品溶液(101.4 μg/mL)20 mL，25 mL，30 mL各3份，制成供试品溶液，按色谱条件测定。结果见表6。

表6 野黄芩苷镁原位凝胶的加样回收率试验

2.7 野黄芩苷镁鼻用温敏原位凝胶的含量测定

精密称取野黄芩苷镁鼻用温敏型原位凝胶6份，制成供试品溶液，按色谱条件测定，计算平均值，得野黄芩苷镁含量为4.907 mg/mL。

表7 野黄芩苷镁鼻用温敏原位凝胶的含量测定 (mg/mL)

3 讨论

为了提高野黄芩苷镁的生物利用度，本试验以P407和P188为凝胶基质。泊洛沙姆是一种由聚氧乙烯(PEO)和聚氧丙烯(PPO)组成的PEO-PPO-PEO型非离子三嵌段共聚物，具有良好的安全性[17]。且低温时为液态，高温便转变成凝胶状态，这是因为溶液-凝胶转化温度受PEO/PPO比例、聚合物浓度等的影响[18]。但由于单独使用P407时，凝胶的黏附力与机械性能比较差[19]，所以添加少量的P188。P188对溶液的凝胶化温度与P407有相反的影响，这些影响是由于这两种化合物中存在的亲水性PEO和疏水性PPO的比例不同造成的。P188 PEO链含量更高，因而亲水性更强，PEO链跟水分子形成的氢键数目更多，因而高分子链受到破坏的胶凝温度更高。因此，添加P188除了增加凝胶黏附性外，还可以来调节凝胶温度[20-22]

星点设计-效应面法[23-25]是一种运用效应曲面模型分析的多因素五水平的新型实验设计方法，且各因素间的相互影响都能充分考虑到，中心点实验进行多次重复，可信度较好，准确性高。本研究采用此方法，设计优化原位凝胶的处方，结果表明按照最优处方制备的温敏型原位凝胶的相变温度的实测值与预测值非常接近，证明本研究建立的回归方程预测性良好。按照筛选出的最优处方制备的野黄芩苷镁鼻用温敏型原位凝胶，其胶凝温度适宜。