外源性诱导原发性胆汁性胆管炎动物模型研究进展

陈海洋张 玮

(上海中医药大学附属龙华医院 感染科,上海 200032)

原发性胆汁性胆管炎( primary biliary cholangitis, PBC),又称原发性胆汁性肝硬化,是一种慢性肝内胆汁淤积性肝病,其特征是肝内小胆管破坏,门脉周围炎症、纤维化,最终导致肝硬化。PBC 的血清学特征是抗线粒体抗体( antimitochondrial antibody, AMA)阳性,这是一种在约95%的PBC 患者中发现的高度疾病特异性抗体[1]。多个国家流行病学研究表明PBC 的总体发病率为8.55/100 万/年,患病率为118.75/100 万/年,我国目前无论是发病率还是患病率都要高出平均水平[2]。 国外流行病学显示尿路感染、香烟、有毒废弃物和工业地区等环境污染以及贫困等因素容易诱发本病[3-5]。 Chen 等[6]在对上海部分地区19012名居民抗线粒体抗体M2 亚型(anti-mitochondrial antibody subtype M2, AMA-M2)的筛选调查中发现住在垃圾填埋场和高架附近,吸烟以及使用染发剂等被认为是危险因素。 最新流行病学也显示城市工业区,环境污染和社会贫困地区人群的PBC 患病率较高[5]。 Probert 等[7]在垃圾填埋场发现了可以抑制线粒体氧化磷酸化和诱导肝祖细胞凋亡的化学物质,其结构是一种类似硫辛酸的人肝细胞代谢产物,并且可以通过外源性脂酰化途径在酶催化下与丙酮酸脱氢酶复合物的E2 成分相结合。 多项研究显示外源性化学药物或异物可能通过修饰丙酮酸脱氢酶复合物E2 亚单位(pyruvate dehydrogenase complex E2 subunit, PDC-E2)或其他自身抗原,导致自身免疫易感个体耐受性丧失从而诱发PBC 的发病[8-9]。 外源性诱导动物模型更加类似环境因素对PBC 发病的影响,所以有必要对外源性诱导PBC动物模型的方法和特点进行系统总结(见表1),以便根据研究目的选择恰当的模型。

表1 不同外源性物质诱导PBC 动物模型总结Table 1 Summary of animal models of PBC induced by different exogenous substances

1 药物诱导模型

1.1 2-辛炔酸偶联牛血清白蛋白(2-octynoic acid BSA conjugate, 2-OA-BSA)诱导模型

绝大多数PBC 患者都伴有不同程度的抗线粒体抗体反应,这些抗体识别的自身抗原是2-氧酸脱氢酶复合体(2-oxo-acid dehydrogenase complex, 2-OADC)的成员,特别是PDC-E2。 实际上,这些抗体也会与许多化学修饰过的类似物发生交叉反应[9,24]。 2-辛炔酸(2-octynoic acid, 2-OA)不仅具有在体内修饰PDC-E2 的潜力,而且重要的是,它被广泛应用于环境中,包括香水、口红等化妆品和许多常见的食品调味料中[9]。

Wakabayashi 等[10]首先使用外源性2-OA 与牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)偶合(100 μg/25 μL),对雌性C57BL/6 小鼠进行免疫,成功诱导出类PBC 动物模型。 造模方法:2-OA-BSA 与完全弗氏佐剂(Freund’s adjuvant complete, CFA)偶合,进行首次腹腔注射,其后将2-OA-BSA 与不完全弗氏佐剂(Freund’s adjuvant incomplete, IFA)进行偶合,每隔2 周对模型小鼠腹腔注射1 次,持续12～24 周。 模型特征:最早在免疫4 周后血清中即可检测到PDC-E2 抗体阳性并显著升高,8 周即达100%。 肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor, TNFα)和干扰素γ(interferon-gamma, IFN-γ)在免疫4周后也显著增高。 IL-4、IL-5 和IL-10 基本没有变化。 组织学上免疫14 周后肝切片显示门管区淋巴细胞浸润,小胆管损伤或消失,肝内或见肉芽肿形成。 肝内CD4/CD8T 细胞的比值降低,而CD8+T 细胞的数量显著增加。 Lleo 等[11]发现在PBC 患者中,受损胆管周围的门管区也存在典型的CD4+T 和CD8+T 淋巴细胞浸润。 虽然该模型有PBC 典型胆管周围淋巴细胞浸润,但是纤维化改变和反映胆汁淤积程度的相关酶测定却仍然存在缺陷。 然而,2-OA 可用于多种小鼠品系和转基因小鼠[25-26],达到模型的理想病理改变,也表明2-OA 诱导模型的广泛应用前景,值得进一步探索。

Wu 等[12]、Chang 等[13]发现半乳糖苷基神经酰胺(α-GalCer)激活iNKT 细胞会加重汇管区炎症反应、胆管损伤、肉芽肿形成和肝纤维化发生的趋势。所以Chang 等[14]修改造模的实验方案,除以上干预措施外,另加α-GalCer 用0.5%吐温20 溶解成0.2 mg/mL,取10 μL 分别于第1、2、3 次免疫接种的前1 d 静脉注射至小鼠体内。 方案修改后造模小鼠在免疫4 周后即出现更加明显的门脉炎症、胆管损伤。更为欣喜的是修正后12 周的模型可提高AMA 产生,肉芽肿形成和肝纤维化改变征象。 Zeng 等[27]、Miyake 等[28]根据这种免疫小鼠模型还发现iNKT细胞和自身抗体的关系也具有一致性。 这个发现说明不仅适应性免疫参与PBC 的发展,而且先天性免疫在本病的发生发展中也起着重要的作用。

1.2 聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(polyinosinicpolycytidylic acid , polyI:C)诱导模型

PolyI:C 是一种干扰素诱导剂,触发I 型干扰素(IFN-1)的产生和下游IFN-α/β 受体依赖信号通路,通过打破人体耐受性促进后续自身免疫反应[29-31]。 持续产生IFN-1 会使免疫系统几乎所有成分转向病理功能,导致组织损伤和疾病[32]。 许多系统性自身免疫性疾病患者有持续产生IFN-1 的迹象,并显示IFN-α 调控基因表达增加[33-34]。 此外,多个病例报道在没有自身免疫性疾病的情况下使用干扰素治疗期间患者出现了自身免疫性肝炎的临床和病理特征[35-37]。 提示IFN 系统在自身免疫性疾病的发病机制中起关键作用。

Okada 等[15]使用IFN-1 的诱导剂polyI:C 建立自身免疫性胆管炎动物模型。 造模方式:6 ～8 周的雌性C57BL/6 小鼠,每周腹腔注射2 次polyI:C,以5 mg/kg 为造模最佳浓度,连续造模28 周,成功建立PBC 小鼠模型。 模型特点:造模8 周后组织学可见胆管损伤,胆管周围淋巴细胞浸润明显,门管区淋巴细胞的浸润数量在造模16 周达到最高,此后基本稳定维持这一水平。 模型小鼠血清在8 周后可以检测到自身抗体,到24 周后87%的模型小鼠可检测AMA。 此外,IFN-α 在造模4 周已经高表达,但到16周后开始降低,24 周处于较低的状态。 Hanada等[38]认为IFN-β 和IFN-α 可以直接破坏胆管细胞紧密连接的屏障功能,通过改变胆管细胞旁路途径来增加胆管细胞通透性。 然而Stewart[16]认为降低干扰素会减少自身抗体和组织免疫损伤,IFN-α 低表达的情况下,IFN-β 也会出现低表达。 奇怪的是这种现象与病理进展相互矛盾,可能是因为其他细胞因子对干扰素的调节所致,至于具体内在联系仍需进一步研究。

1.3 2OA-BSA 联合polyI:C 诱导模型

Ambrosini 等[17]认为2OA-BSA 诱导的PBC 模型肝纤维化的病理特征不符合后期肝纤维化的病理征象,所以在此基础之上联合polyI:C,达到了较好的效果。 造模方法:在首次2OA-BSA 联合CFA腹腔注射诱导后每3 d 加用5 mg/kg 剂量的polyI:C,干预8 周后处死小鼠。 和2OA-BSA 诱导模型相比有以下异同。 相同:两者肝组织有相同程度的淋巴细胞浸润、肉芽肿形成和胆管损伤。 两者产生的抗体和CD4+T 细胞水平相当。 不同点:联合polyI:C 诱导的模型Th1 细胞因子、IL-12、IFN-γ 和TNF-α增多,CD8+T 细胞和嗜酸粒细胞数量增多,门脉汇管区炎症和纤维化形成明显,此外造模时间只需要8 周。 但是polyI:C 可有效激活免疫系统,联合使用后促使造成严重的腹腔炎症,提高了动物死亡率。polyI:C 在2OA 免疫诱导下进行二次免疫,证实PBC 如同其他自身免疫性疾病一样,属于多系统协调免疫反应。

2 抗原诱导模型

2.1 微生物诱导模型

流行病学研究表明PBC 与复发性尿路感染有关[39-40]。 Selmi 等[41]发 现 PBC 患 者 血 清 对

(Novosphingobiumaromaticivorans,N.aromaticivorans) 的反应活性比对大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)要高出100～1000 倍。 其后又进一步将N. aromaticivorans、E. coli等多种细菌的PDC-E2 内结构域氨基酸序列对比发现前者与人类的PDC-E2 具有最高的同源性,并且在对比几种细菌诱导PBC 模型特点后,认为N. aromaticivorans比之前提出的E. coli、螺杆菌(Helicobacter species, Hp)要更可能诱导PBC 的发病[42]。

Mattner 等[18]使用N. aromaticivorans打破免疫耐受造出具有显著自身免疫特点的PBC 小鼠模型。造模方法如下:制备N. aromaticivorans细菌悬液(每100 μL 含有5×107个)。 分别于第1 天和第14 天将细菌悬液静脉注射到4 ～20 周非肥胖型糖尿病(non-obesity diabetes, NOD)小鼠体内进行活体感染。 模型特点:活体感染1 个月后小鼠肝脾质量较前增加; 主要组织相容性复合体( major histocompatibility complex, MHC)II 类分子在受损小胆管的表达;可见严重的门脉浸润和胆管损伤,并伴有部分纤维化改变。 这种表现在感染E. coli的小鼠肝组织中未发现。 造模6 个月后门脉炎症、胆管损伤和肉芽肿形成相比E. coli感染要具有明显差异。 血清检测表明感染2 周后小鼠即出现PDCE2 和AMA 的聚集,伴有T 淋巴细胞浸润小胆管的现象,并持续长时间高水平的IgG。 尽管如此,这种模型却未出现与人类PBC 发展进程中相似的肝纤维化表现。 但有研究表明这种肝纤维化改变不明显可能是由于NOD 遗传背景之下IFN 的高表达[43]。 这也提示PBC 疾病的发生可能与某种遗传易感性基因有关。 Wang 等[19]分别用E. coli和N.aromaticivorans感染NOD 小鼠建立PBC 模型,发现E. coli感染小鼠会导致更加明显的胆管炎症损伤并且产生更高浓度的AMA,然而与PBC 患者血清相比,E. coli感染小鼠对PDC-E2 的血清学抗体反应却相对较弱[44],尽管如此Wang 认为在感染E. coli的早期足以打破免疫耐受并导致类似于PBC 的肝病理表现。

2.2 抗线粒体抗体抗原(AMA 抗原)诱导模型

英国的一项临床研究发现检出M2 抗体阳性的无症状患者在出现PBC 症状和体征之前,时间间隔长达10 余年之久[45]。 目前依靠常规使用的血清AMA 检测,其特异性和敏感性还不够,仍有一部分病人出现漏诊[46]。 所以提高对PBC 诊断的敏感性显得尤为重要。 Kikuchi[47]和Miyakawa 等[48]将AMA 反应的主要自身抗原克隆并鉴定为2-氧代酸脱氢酶复合体家族成员:丙酮酸脱氢酶复合体E2(PDC-E2), 支链 2-氧代酸脱氢酶复合体-E2(BCOADC-E2) 和2-氧戌二酸脱氢酶复合体-E2(OGDC-E2)。 并且也发现有些患者的血清与BCOADC-E2 和OGDC-E2 是可以反应的。 多年前Moteki 等[49]将牛、大鼠和人类线粒体抗原的混合物,即3 个不同支链结构域杂交克隆,命名为pMLMIT3,用于PBC 病人检测发现可以明显提高检出率。

Jiang 等[20]根据基因工程的方法将人源靶抗原连接加工后获得重组抗原蛋白三联体(重组AMA抗原),据此成功模拟PBC 模型[21]。 造模方法:每只小鼠(C57BL/6)一次腹腔注射重组抗原蛋白三联体100 μg/200 μL。 模型特点:在免疫66 周后病理显示肝小叶无明显淋巴细胞浸润和肝细胞坏死表现,并且可见汇管区淋巴细胞浸润和小胆管损伤。血清中AMA-M2 抗体阳性率达100%,并且谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)无明显变化,以上特征与早期PBC 相似。 此外具有肝特异性,灵敏度高,已尝试投入临床用于辅助PBC 疾病的筛查[22]。Miyakawa 等[50]通过克隆人源cDNA 利用新开发的酶联免疫吸附法来表达重组蛋白,用于PBC 阴性病人的检测,有90%与至少1 个重组蛋白发生免疫印迹反应。

2.3 胆管蛋白(bile duct protein, BDP)诱导模型

根据PBC 发病的典型特征,Ma 等[23]通过同源BDP 免疫诱导方式建立PBC 小鼠模型。 造模方法:8～12 周龄小鼠(C57BL/6)通过门静脉灌注原位胶原酶IV,10 min 后剪裁肝,用软牙刷刷去肝细胞,直到可见整个胆管树。 将胆管树置于原位胶原酶IV中震荡10 min,分离粘附的肝细胞。 在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤3 次后,将胆管树置于PBS,制备胆管细胞蛋白匀浆,并进行蛋白定量。 将4 mg/mL的BDP 与CFA 等体积乳化,完全乳化后,取BDPCFA 乳剂在小鼠背部多点皮下注射,每周1 次,免疫3 次。 随后将BDP 与IFA 乳化,BDP-IFA 乳剂仅在最后一次免疫中使用,BDP-IFA 处理1 周后处死小鼠,进行分析。 模型特点:在病理中发现门静脉汇管区胆管周围严重的肝特异性炎症,肝和脾中CD4+T 和CD8+T 细胞的数量和激活状态增加。 以及由T 细胞抗原呈递细胞组成的树突状细胞在肝和脾的数量也有所增加。 此外,该模型中脾的生发中心反应更强。 血清中AMAs 100%阳性,并增加了血清中的AMAs,包括抗PDC-E2、BCOADC-E2 和OGDC-E2。 该模型的建立主要依赖于胆管抗原,而在人类中,胆管抗原再次表明分子拟态参与触发或促进PBC 发病。

3 讨论与展望

除了临床样本、环境研究、体外实验和流行病学数据外,动物模型是理解和寻找PBC 临床方案不可或缺的工具。 到目前为止,PBC 的发病机制仍然不够清晰,只是对该疾病发展过程和预后有一定了解。 熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid, UDCA)是唯一经FDA 认证的一线药物[51],但也只能改善患者胆汁淤积的状态,无法根本治愈。 在实际临床中有高达30%的PBC 患者对UDCA 应答欠佳,应答欠佳不仅会提高并发症的发生率,更容易进展为肝硬化,甚至需要肝移植,这类患者是快速发展至晚期肝病的高风险人群[52-54]。 临床二线贝特类药物联合UDCA 也仅仅可以改善血清相关指标,与单独使用UDCA 相比,对症状和死亡率的影响并没有显著差异[55]。 因此,当务之急在于尽早探明本病的发病机制以研发更适合PBC 的新药。

目前建立的动物模型只能模拟PBC 某一病理阶段,还不能完整模拟其病理过程。 人体生活在复杂环境中,自身免疫性疾病是环境多因素刺激和遗传因素导致免疫耐受破坏所致。 以上构建的小鼠模型各有特点,启示我们单因素造模方法只能拟合出接近PBC 某一阶段病理特点的动物模型,联合使用比如2OA-BSA 联合polyI:C 可以较好提高动物模型拟合度。 对于这种病理过程复杂的疾病模型应该打破传统单因素造模思路,从多因素(不局限外源性诱导)考虑,或者结合肝纤维化、肝硬化疾病动物模型造模方法,采取复合多因素造模方法,探索出更加符合人类PBC 发病特点的动物模型。