复方天麻蜜环糖肽片对原发高血压大鼠T 淋巴细胞亚群、早期肾损伤及AT1R/Smad3 蛋白作用机制研究

冯 静张贤春

(海口市人民医院,海口 570208)

原发性高血压(spontaneous hypertension,EH)具有高致残率、高死亡率,严重者会导致心血管疾病的发生[1]。 原发性高血压在临床上主要表现为体循环动脉压的增高,同时伴有器官功能或器质性损害,严重的高血压患者导致脑卒中等疾病的发生[2]。 目前,高血压患者随着社会生活节奏的加快而逐年增加,有数据统计发现,我国目前为止高血压患者的患病率高达25%。 原发性高血压的发病机制相对复杂,目前尚没有文献明确的报道。 近些年研究显示,血管的炎性反应和内皮损伤介导着高血压疾病的发生、发展[3]。 还有学者研究发现,在高血压患者的血管壁内有大量的炎症反应,并且在高血压的发生中这种炎症反应起主导作用[4]。 目前我国主要通过研究CD4+T 淋巴细胞亚群来反应原发性高血压的炎症免疫反应,虽有很多的文献报道,但CD4+T 淋巴细胞亚群在高血压疾病中的作用机制还不是十分清楚。 血管紧张素Ⅱ会和它的受体之一zAng Ⅱ1 型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R)相结合,进而让血管发生收缩,释放大量的醛固酮,增加细胞增生,这些不良效应主要由AT1R 所介导[5]。 有文献报道显示,在高血压患者的血清中发现了AT1R 抗体,因此推测机体的免疫功能介导高血压疾病的发生[6]。 Smad(small mother against decapentapiegic)蛋白是转化生长因子(TGF)信号通路中重要的细胞内作用底物,其中Smad3 是其中的一种亚型[7]。 现有研究显示,TGF/Smad 信号通路在心血管疾病中的发生发展过程中发挥重要的作用,Smad 蛋白从基因转录水平参与调控心血管疾病的发生发展过程[8],但AT1R、Smad3在高血压中的表达还尚不清楚。 复方天麻蜜环糖肽片是一种生物重要复方制剂,主要提取于天麻蜜环菌、黄芪和当归中,可以有效防止眩晕,且对舒筋活血有一定的效果,复方天麻蜜环糖肽片不仅服用方便,不良反应也相对较小[9-10]。 目前,还没有复方天麻蜜环糖肽片对高血压作用的相关报道,本文旨在探究复方天麻蜜环糖肽片对原发性高血压大鼠T 淋巴细胞亚群、早期肾损伤及AT1R、Smad3 蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

大鼠购自浙江中医药大学动物实验中心[SCXK(浙)2017-0015],所有大鼠饲养在海南医学院[SYXK(琼)2019-0008]。 40 只SHR 大鼠,20 只Wistar-Kyoto(WKY)大鼠,所有大鼠皆为SPF 级、雄性,8 周龄,体重180 ～200 g。 所有大鼠均饲养在统一的动物房内,保证环境清洁,且室内温度保持在23℃～25℃,相对湿度保持在45%～50%,动物实验过程经海口市人民医院动物实验伦理委员会批准(20120LL077),本次实验符合3R 原则。

1.2 主要试剂与仪器

山西康欣药业有限公司生产的复方天麻蜜环糖肽片(批准文号: H14022944); 美国 Assay Biotechnology 公司生产的AT1R 抗体和Smad3 抗体;美国BD 公司生产的CD3+、CD4+、CD8+检测试剂盒。 上海奥尔科技生物科技有限公司生产的大鼠无创血压测量分析系统;日本奥林巴斯株式会社生产的BH2 型光学显微镜。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与造模

20 只WKY 大鼠作为正常组(NC 组)、40 只SHR 大鼠分为模型组(SHR 组)和药物组(TMGT组),每组20 只。 将1 g 复方天麻蜜环糖肽片用生理盐水稀释成3 mL 复方天麻蜜环糖肽溶液,TMGT组大鼠给予1 g/kg 天麻蜜环糖肽溶液灌胃干预,每天3 次,连续干预8 周;NC 组大鼠和SHR 组大鼠均给予等量的生理盐水灌胃干预,每天3 次,连续干预8 周。

1.3.2 动物血压测量

在给药干预后0、2、4 和8 周时,分别测量NC组、SHR 组和TMGT 组大鼠的尾动脉收缩压。 在测量时先把无创血压检测仪进行预热,在大鼠的根部套上血压计的充气尾,在大鼠处于安静状态时,对大鼠的血压进行测量,每组大鼠分别测量3 次,取平均值。

1.3.3 流式细胞仪检测外周血T 淋巴细胞亚群

分别麻醉NC 组、SHR 组和TMGT 组大鼠,采集大鼠腹主动脉血液3 mL,离心处理后,弃掉上清液,将PBS 溶液加入其中进行稀释,充分混匀后,在淋巴细胞分离液上铺满液体,离心后把中间的白层膜部分取出,再次离心后,把上清液弃掉,重悬细胞制备成淋巴细胞悬液。 将悬液放置在测定管中,分别设为空白管和对照管,在管中加入CD3+、CD4+、CD8+荧光抗体,轻摇测定管混匀,在室温环境中孵育,20 min 后再次用PBS 溶液重悬,最后对T 淋巴细胞亚群进行检测。

1.3.4 ELISA 检测血清中IL-6、TNF-α 的含量

分别取NC 组、SHR 组和TMGT 组大鼠的腹主动脉血,2000 r/min 的速度离心5 min,取出离心后的上清液,分别测量各组大鼠血清中IL-6、TNF-α 的含量。

1.3.5 肾组织病理学观察

采用HE 染色和PAS 染色切片法,处死3 组大鼠后取出肾组织,将制备好的切片组织放置在图像分析仪上,分别观察NC 组、SHR 组和TMGT 组大鼠肾组织的病理变化。

1.3.6 Western blot 检测肾组织中AT1R、Smad3 蛋白表达

分别取NC 组、SHR 组和TMGT 组大鼠50 mg肾组织,用Western blot 裂解液裂解后用玻璃均浆器在冰上对组织进行研磨,30 min 后以12000 r/min的速度离心5 min,取上清液,蛋白浓度用BCA 法进行检测,在每孔中加入50 μg 蛋白样品,根据蛋白浓度计算样本体积。 把浓缩的SDS-PAGE 缓冲液加入到上清液中,加热上清液,5 min 后在预制的胶孔中把蛋白样本加入,在封闭的环境中孵育。 1 h 后加入一抗,TBST 溶液将蛋白样品清洗3 次,凝胶成像系统曝光成像,进一步分析。

1.3.7 RT-PCR 检测Smad3 和AT1R 蛋白表达

分别取NC 组、SHR 组和TMGT 组大鼠50 mg肾组织,用TRIzol 裂解液将组织裂解,而后提取组织中总的RNA。 分别检测肾组织中AT1R、Smad3 mRNA 的表达。 引物序列:AT1R 上游引物:5’-GAGAGGATTCGTGGCTTGAG-3’, 下 游 引 物: 5’-TAAGTCAGCCAAGGCGAGAT-3’;Smad3 上游引物:5’-CCTGGCTACCTGAGTGAAGATG-3’,下游引物:5’-AGTAGGAGATGGAGCACCAAAAC-3’。 扩 增 条件:95℃预变性2 min;95℃预变性15 s;60℃退火1 min,共计40 个循环。 AT1R、Smad3 mRNA 相对表达量用2-△△Ct法进行计算。

1.4 统计学方法

应用SPSS 20.1 软件对NC 组、PT 组和miR-223 组的数据进行分析。 用平均数±标准差( ¯x±s)的形式表示3 组间的数据,3 组间的数据比较用单因素方差法进行检验,两组间比较采用LSD-t进行检验;以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠尾动脉收缩压测量比较

和NC 组大鼠相比,SHR 组和TMGT 组大鼠给药后0 周尾动脉收缩压均明显升高(P＜0.05),但给药后0 周SHR 组和TMGT 组大鼠尾动脉收缩压没有明显的变化(P＞0.05)。 和NC 组相比,SHR 组在给药后2、4 和8 周时大鼠尾动脉收缩压显著升高(P＜0.05);和SHR 组给药后2、4 和8 周时大鼠尾动脉收缩压相比,TMGT 组大鼠均得到显著抑制(P＜0.05),见表1。

表1 各组大鼠不同时间尾动脉收缩压测量比较(¯x±s,n=20)Table 1 Comparison of tail artery systolic blood pressure in different groups at different time

2.2 各组大鼠外周血CD4+和CD8+细胞表达频率及CD4+/CD8+比值

NC 组大鼠外周血CD4+细胞表达频率为(63.21±2.13),CD8+细胞表达频率为(34.21±1.65);SHR 组大鼠外周血CD4+(81.15±2.62)细胞表达频率较NC组显著升高(P＜0.05),CD8+(25.33±1.96)细胞表达频率较NC 组显著降低(P＜0.05);干预后的TMGT 组大鼠外周血CD4+(66.73±1.57)细胞表达频率较SHR组显著降低,CD8+(32.76±2.35)细胞表达频率较SHR 组显著升高(P＜0.05)。 和NC 组大鼠CD4+/CD8+比值(1.62±0.15)相比较,SHR 组大鼠CD4+/CD8+比值(2.26±0.31)显著升高(P＜0.05);干预后的TMGT 组大鼠的CD4+/CD8+比值(1.85±0.12)较SHR 组显著降低(P＜0.05),见图1 和图2。

图1 流式细胞仪检测各组大鼠外周血CD4+和CD8+细胞表达频率及CD4+/CD8+比值Figure 1 Expression frequency of CD4+and CD8+cells and the ratio of CD4+/CD8+in peripheral blood of rats in each group were detected by flow cytometry

注:与NC 组相比,*P＜0.05;与SHR 组相比,#P＜0.05。

2.3 血清中IL-6、TNF-α 含量比较

和NC 组大鼠血清中炎症因子IL-6 和TNF-α含量相比较,SHR 组大鼠显著升高(P＜0.05);和SHR 组相比,TMGT 组大鼠血清中IL-6 和TNF-α 含量显著降低(P＜0.05),见表2 和图3。

注:与NC 组相比,*P＜0.05;与SHR 组相比,#P＜0.05。

表2 各组大鼠血清中IL-6、TNF-α 含量比较(¯x±s,n=20)Table 2 Comparison of IL-6 and TNF-α in serum of rats in each group

2. 4 三组大鼠肾组织病理学变化比较

和NC 组大鼠肾组织比,SHR 组大鼠肾小球明显增大,基底膜增厚且肾小球出现大量的空炮,毛细血管明显狭窄,且出现闭塞;和SHR 组大鼠肾组织比,TMGT 组肾组织得到了明显的改善,见图4。

注:A:大鼠肾组织HE 染色;B:大鼠肾组织PAS 染色。

2.5 各组大鼠肾组织中Smad3 和AT1R 蛋白表达比较

和NC 组大鼠肾组织中Smad3 和AT1R 蛋白表达相比较,SHR 组均显著增加(P＜0.05);和SHR 组相比,TMGT 组大鼠肾组织中Smad3 和AT1R 蛋白表达均显著降低(P＜0.05),见图5。

注:A:3 组大鼠肾组织中Smad3 蛋白和AT1R 蛋白表达;B:3 组大鼠肾组织中Smad3 蛋白和AT1R 蛋白表达比较。 与NC 组相比,*P＜0.05;与SHR 组相比,#P＜0.05。

2.6 各组大鼠肾组织中Smad3 和AT1R mRNA表达比较

NC 组大鼠肾组织中Smad3 和AT1R mRNA 分别为(1.01±0.10)和(0.27±0.02);SHR 组大鼠肾组织中Smad3 mRNA(3.27±1.21)和AT1R mRNA(0.89±0.05)较NC 组均显著增加(P＜0.05);和SHR 组相比,TMGT 组大鼠肾组织中Smad3 mRNA(1.58±0.23)和AT1R mRNA(0.34±0.03)显著降低(P＜0.05),见图6。

注:与NC 组相比,*P＜0.05;与SHR 组相比,#P＜0.05。

3 讨论

高血压是一种慢性的炎症反应,其发病机制和很多因素都有密切关系,例如遗传基因、肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活、胰岛素抵抗及血管内皮功能受损等,以上因素均可导致机体的免疫功能发生紊乱[11]。 研究发现,免疫功能在高血压疾病中起主导作用,高血压发生时,在血管周围常发现大量的炎症反应,在机体中炎症免疫发生作用,增加趋化因子的表达,升高黏附因子的含量,同时增加超氧化物的释放,从而加强机体的氧化应激反应[12]。炎症免疫系统会降低血管的舒张功能,召集大量的内皮细胞,包括T 淋巴细胞等,增加内皮细胞的数量且增强细胞的粘附性,进而升高血压[13]。 文献显示,炎症免疫失调介导着高血压的发生发展,高血压的患病率会随着炎症因子的增加而增加[14]。 可见,免疫炎症反应参与者高血压的发生、发展。 天麻为兰科植物,其干燥块茎为常用名贵中药,其具有很高的药用价值和经济价值。 蜜环菌隶属于担子菌亚门伞菌目白磨科蜜环菌属。 蜜环菌是天麻生长发育的基础,为天麻的生长发育提供养分。 有研究发现,复方天麻蜜环糖肽片可提高外周动脉血管的顺应性,让大脑的血量得到增加,与此同时也加强了中央血管的顺应性,进而达到降低血压的效果[15]。 本实验结果显示,SHR 组大鼠尾静脉收缩压较NC 组显著升高,在复方天麻蜜环糖肽片干预后大鼠的动脉收缩压得到明显抑制,提示复方天麻蜜环糖肽片可有效改善高血压大鼠血管的舒缩功能,进而实现降压的目的。

T 淋巴细胞参与着高血压疾病的发生发展,在高血压发生时,活化的T 淋巴细胞向肾及外周血管迁移,可见调节免疫系统和高血压的发生密切相关。 本研究发现,SHR 组大鼠外周血CD4+/CD8+淋巴细胞的比值较NC 组明显升高,说明机体内的T淋巴细胞数量发生异常变化,导致免疫系统失衡,让机体处于免疫抑制状态。 经过复方天麻蜜环糖肽片干预后大鼠的CD4+/CD8+淋巴细胞比值得到明显抑制,可见复方天麻蜜环糖肽片对高血压大鼠的T 淋巴细胞的数量进行调节,改善机体的免疫系统,进而调节机体的血压处于正常状态。 张小娟等[16]通过对高血压患者临床研究证实,给予复方天麻蜜环糖肽片的观察组患者的治疗效果明显好于给予非洛地平缓释片联合缬沙坦的对照组患者,以复方天麻蜜环糖肽片对辅助治疗高血压的效果显著。 近些年有学者研究发现和高血压有关的炎症标记物有IL-6、TNF-α 等,本研究结果发现,SHR 组大鼠血清中IL-6、TNF-α 含量显著高于NC 组,复方天麻蜜环糖肽片干预后高血压患者血清中炎症因子IL-6、TNF-α 含量均得到明显抑制,可见复方天麻蜜环糖肽片在高血压发生中有效调控IL-6、TNF-α促炎因子,进而发挥良好的抗炎效果。 丁东新等[17]研究发现,老年原发性高血压患者血清中有大量炎症因子IL-6、TNF-α 标记物,且炎症标记物和血压的严重程度成正相关。

血管紧张素Ⅱ是RAS 最重要的血管活性物质,主要通过AT1R、AT2R 来实现多种生理调节作用。血管紧张素Ⅱ通过AT1R 在循环系统内发挥着收缩血管、调节血压和水钠平衡等作用,而通过AT2R 受体调节扩血管的同时抑制肾小球旁细胞肾素合成[18]。 Smad 可分为Smad1 ～Smad8,其中Smad3 对受体有一定的调节作用。 有研究发现,激活smad 蛋白可通过转录抑制PPAY-γ 的表达,降低PPAY-γ对血管的保护作用,进而加重肺动脉高压的发生。本研究显示,SHR 组大鼠组织中Smad3 和AT1R 蛋白及相对表达量均高于NC 组大鼠,Smad3 升高说明高血压大鼠肾受损,给予复方天麻蜜环糖肽片干预后高血压大鼠肾组织中Smad3 和AT1R 蛋白及相对表达量得到明显抑制,提示复方天麻蜜环糖肽片可抑制Smad3 和AT1R 蛋白表达,进而延缓高血压性肾病的进程。 伊林等[19]研究发现,当归可能通过其有效成分藁苯内酯对血压有干预作用,可能通过AT1R 靶点发挥作用。 李撵萍[20]研究发现,复方天麻蜜环糖肽片联合硝苯地平对高血压患者起有效的治疗效果,并且无严重的不良反应发生,值得临床使用。

综上所述,复方天麻蜜环糖肽片可有效调节高血压大鼠T 淋巴细胞亚群,改善机体的免疫功能,缓解高血压导致的早期肾损伤,同时抑制肾组织中的Smad3 和AT1R 蛋白表达,进而对高血压疾病进行治疗。